Tải bản đầy đủ (.pdf) (73 trang)

Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase hTERT

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.26 MB, 73 trang )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
…………………

Hoàng Thị Ngà

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ NANO CHITOSAN
MANG GEN MÃ HÓA TELOMERASE REVERSE
TRANSCRIPTASE (hTERT)

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội, 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
…………………

Hoàng Thị Ngà

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ NANO CHITOSAN
MANG GEN MÃ HÓA TELOMERASE REVERSE
TRANSCRIPTASE (hTERT)
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÃ THỊ HUYỀN
PGS. TS. NGUYỄN QUANG HUY



Hà Nội, 2013


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin gửi lời cảm cám ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Lã
Thị Huyền, PGS. TS. Nguyễn Quang Huy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp
đỡ tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn, Trƣởng
phịng Phịng Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn
lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, và tạo mọi điều kiện
trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới NCS. Lê Thị Thùy Dƣơng, NCS. Lê Thị Hạnh,
CN. Phạm Văn Phúc và các anh chị tại phịng Cơng nghệ tế bào động vật đã giúp
đỡ rất nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong q trình học tập tại đây.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo dạy Khoa Sinh học, Bộ
môn Sinh lý thực vật và hóa sinh, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hà Nội đã dạy bảo và giúp đỡ trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và bạn bè luôn động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt q trình học tập và hồn thành luận văn.
Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2013
Học viên

Hoàng Thị Ngà


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH


DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase ...............................................3
1.1.1. Giới thiệu chung telomere ở người ............................................................3
1.1.2. Hoạt động telomerase ở người .................................................................5
1.1.3. Tình hình nghiên cứu hTERT .....................................................................7
1.1.4. Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT .....9
1.2. Tổng quan về chitosan ....................................................................................11
1.2.1. Giới thiệu chung chitosan .......................................................................11
1.2.2. Ứng dụng của chitosan ...........................................................................13
1.2.3. Giới thiệu chung về nano chitosan ..........................................................14
1.2.4. Chitosan, chất mang dẫn truyền gen ......................................................16
1.2.5. Các phương pháp tạo nano chitosan .......................................................16
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................22
2.1. Vật liệu ...........................................................................................................22
2.1.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................22
2.1.2. Thiết bị .....................................................................................................22
2.1.3. Môi trường và dung dịch .........................................................................23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................24
2.2.1. Phương pháp tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) ........24
2.2.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn .................................................25
2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................26
2.2.4. Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose ...........................................26
2.2.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli ..................................27


2.2.6. Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pcDNA3.1 (+) đã tích hợp
gen mã hóa hTERT ............................................................................................28

2.2.7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn .................................28
2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA ..............................29
2.2.9. Phương pháp tạo hạt nano chitosan ........................................................29
2.2.10. Phương pháp tạo phức hệ nao chitosan/vector mang hTERT ...............31
2.2.11. Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron
Microscope – SEM) ...........................................................................................31
2.2.12. Phương pháp đo size, phân bố size và thế zeta .....................................32
2.2.13. Phương pháp xác định hiệu quả đóng gói .............................................36
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................37
3.1. Thiết kế vector pcDNA3.1(+) mang đoạn gen mã hóa cho epitope của
telomerase reverse transcriptase (hTERT) .............................................................37
3.1.1. Tổng hợp đoạn gen hTERT ......................................................................37
3.1.2. Chuẩn bị vector pcDNA3.1 mở vòng với hai enzyme BamHI và XbaI ....37
3.1.3. Gắn đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) và chọn lọc vector
pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT ...............................................39
3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen hTERT trong plasmid tái tổ hợp ..................41
3.2. Kết quả tạo hạt nano chitosan .........................................................................42
3.2.1. Tạo chitosan phân tử lượng thấp từ chitosan phân tử lượng trung bình 42
3.2.2. Tạo hạt nano chitosan/TPP .....................................................................43
3.3. Kết quả tạo phức nano chitosan mang plasmid DNA mã hóa cho hTERT ....47
3.3.1. Tạo hạt nano chitosan mang vector tái tổ hợp pcDNA3.1/hTERT ..........47
3.3.2. Đánh giá khả năng mang DNA của hạt nano chitosan ...........................50
KẾT LUẬN ...............................................................................................................53
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................55


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ


Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

viết tắt
APC

Antigen presenting cell

Tế bào trình diện kháng nguyên

bp

Base pair

Cặp base

Chi

Chitosan

Chitosan
Cộng sự

Cs
CTL

Cytotoxic T lymphocyte

Tế bào lympho T gây độc


DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

EDTA

Ethyenediaminetetraacetic acid

Axit ethyenediaminetetraacetic

E.coli

Escherichia coli

Vi khuẩn Escherichia coli

hTR

Human temlate for replication

hTERT Human

telomerase

reverse

transcriptase

TCR

T-cell receptor

MHC

Major

Thụ thể tế bào T

histocompatibility Phức hệ phù hợp tổ chức chính

complex
HLA

Human leucocyte antigen

Kháng nguyên bạch cầu ngƣời

SEM

Scanning Electron Microscopy

Kính hiển vi điện tử quét

PDI

polydispersity index

Chỉ số phân tán


TPP

Tripolyphosphate

kb

Kilo base

LB

Luria Bertani

Mơi trƣờng LB

RNase

Ribonuclease

Enzyme phân hủy RNA

v/ph

Vịng/phút


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. .................4
Hình 1.2. Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere. ...............................5
Hình 1.3. Tổ chức gen của hTERT .............................................................................6

Hình 1.4. Cơ chế vacxin DNA ..................................................................................10
Hình 1.5. Cấu trúc của chitin và chitosan. ................................................................12
Hình 1.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng ...........................17
Hình 1.7. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp giọt tụ ...................................................18
Hình 1.8. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp hợp nhất giọt nhũ tƣơng .......................19
Hình 1.9. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp mixen đảo .............................................20
Hình 1.10. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp tạo gel ion ...........................................21
Hình 2.1. Kính hiển vi điện tử qt S-4800 (FE-SEM, Hitachi). .............................32
Hình 2.2. Bề mặt của hạt nano mang điện tích và thế năng zeta ..............................34
Hình 2.3. Sự biến thiên của thế zeta theo giá trị pH của môi trƣờng ........................35
Hình 3.1. Sơ đồ đoạn gen hTERT .............................................................................37
Hình 3.2. Sơ đồ vector pcDNA3.1(+) .......................................................................38
Hình 3.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng
DH5α .........................................................................................................................40
Hình 3.4. Điện đi đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI ............41
Hình 3.5. Trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn tƣơng ứng của đoạn
gen mã hóa hTERT ...................................................................................................42
Hình 3.6. Cơ chế tƣơng tác giữa chitosan và TPP ....................................................44
Hình 3.7. Kích thƣớc hạt nano chitosan/TPP ............................................................45
Hình 3.8. Thế zeta của hạt nano chitosan/TPP .........................................................46
Hình 3.9. Kích thƣớc hạt nano chitosan-plasmid DNA ............................................47
Hình 3.10. Thế zeta của hạt nano chitosan/plasmid DNA ........................................48
Hình 3.11. Ảnh SEM nano chitosan –plasmid DNA ................................................49
Hình 3.12. Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA .................................50
Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA cắt bằng DNaseI .....51


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. hTERT- epitope gây độc tế bào lympho T [8], [83], [85] ..........................8
Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................................22

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tích hợp gen mã hóa hTERT vào vector
pcDNA3.1(+) ............................................................................................................24
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+) bằng enzyme BamHI và XbaI .25
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+)/hTERT bằng EcoRI .................25
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt plamid DNA bằng enzyme DNase I ...............25
Bảng 2.6. Sự phụ thuộc độ ổn định của hệ keo vào giá trị thế Zeta .........................34


Luận văn thạc sỹ khoa học

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ung thƣ là một căn bệnh hiểm nghèo, bệnh nhân mắc bệnh có tỷ lệ tử vong
cao và hiện nay số ngƣời mắc bệnh ngày càng tăng. Mặc dù cộng đồng y sinh đã rất
nỗ lực nhƣng ung thƣ vẫn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến cái chết, đau khổ và
bệnh tật. Hầu hết các bệnh nhân ung thƣ đƣợc điều trị bởi các liệu pháp: phẫu thuật,
xạ trị hoặc hóa trị. Các phƣơng pháp này cũng chỉ ngăn chặn tạm thời không tiêu
diệt đƣợc tận gốc khối u nguyên phát. Bên cạnh đó, các phƣơng pháp này khơng đặc
hiệu thƣờng gây ra tác dụng phụ gây suy nhƣợc, đau đớn cho cơ thể ngƣời bệnh,
phá hủy các mô khỏe mạnh.
Với hy vọng khắc phục những trở ngại trên, nhiều nhà khoa học đang tập
trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại căn bệnh ung thƣ. Một trong các
liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thƣ, vaccine ung thƣ cung cấp các lợi thế
khác biệt so với phƣơng pháp tiếp cận thông thƣờng: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính,
loại bỏ đƣợc tính kháng thuốc, và tiềm năng bền trong điều trị thông qua bộ nhớ
miễn dịch,... Với sự phát triển của công nghệ nano, vaccine dạng nano đang đƣợc
nghiên cứu. Các vaccine dạng này thƣờng cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo
hộ cao.
Telomerase là một enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép
telomere của đầu cuối nhiễm sắc thể trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn.

Telomerase ở ngƣời là một phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR và hTERT. hTR
(hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và
hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc.
Chúng hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động hoặc
hoạt động rất thấp trong các tế bào soma. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen
mã hóa kháng nguyên hTERT sẽ mang lại nhiều triển vọng ứng dụng trong điều trị
ung thƣ. Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các epitope của hTERT và
nhận thấy rằng chúng có đáp ứng miễn dịch rất tốt với hầu hết các tế bào ung thƣ.

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

1


Luận văn thạc sỹ khoa học

Việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị
ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển vọng, nhƣng để tăng cƣờng quá trình chuyển
DNA và tăng hiệu quả của vacxin cần có một chất mang. Cùng với phát triển của
cơng nghệ nano các chất mang có bản chất polymer có khả năng liên kết và bảo vệ
DNA đã đƣợc chọn làm chất truyền trung gian. Một trong các polymer đặc biệt
đƣợc quan tâm là chitosan, công nghệ nano chitosan hiện nay đã đƣợc sử dụng
trong lĩnh vực y học nhƣ để phân phối thuốc và đang đƣợc ứng dụng trong nhiều
nghiên cứu làm vật liệu dẫn truyền vacxin DNA.
Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một loại polymer khơng độc, có
khả năng phân hủy sinh học và tan tốt trong mơi trƣờng axit. Vì chitosan tích điện
dƣơng nên có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, do vậy nó hứa hẹn là ứng cử
viên tốt cho hệ thống mang gen. Ngoài khả năng chitosan liên kết hiệu quả với
DNA chúng cịn có thể bảo vệ DNA khỏi phân hủy của nuclease. Xuất phát từ
những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase
reverse transcriptase (hTERT)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật
pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên
telomerase reverse transcriptase (hTERT). Hệ vector tái tổ hợp này đƣợc bao gói
trong nano chitosan.
3. Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho
epitope của kháng nguyên hTERT.
- Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thƣớc mong muốn.
- Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT. Đánh giá khả
năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP.

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

2


Luận văn thạc sỹ khoa học

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase
1.1.1. Giới thiệu chung telomere ở người
Nhiễm sắc thể điển hình có chứa một cấu trúc đặc biệt ở hai đầu, đƣợc gọi là
telomere. Telomere là cấu trúc bao gồm một chuỗi lặp đi lặp lại TTAGGG [33],
[48]. Ở ngƣời các chuỗi lặp lại của telomere có từ 5000 đến 15000 base. Telomere
có nhiệm vụ đảm bảo sự bền vững của nhiễm sắc thể, chống lại thối hóa có hại,
chống lại sự tái tổ hợp sai lạc. Trình tự này sẽ mất dần đi sau mỗi lần phân chia, khi
các telomere trở nên quá ngắn thì các nhiễm sắc thể sẽ kém bền vững, chúng không

thể bám đƣợc vào màng nhân tế bào, bị dính vào nhau và có hình dạng kì dị và là
các dấu hiệu dẫn đến sự thối hóa của tế bào.
Ở ngƣời, sự rút ngắn telomere của nguyên bào sợi từ 50-100 cặp base với
mỗi lần tế bào phân chia, và nguyên bào sợi lão hóa sau 50-70 lần phân chia. Vì
vậy, có giả thiết rằng telomere rút ngắn đến một chiều dài nhất định sẽ dẫn đến tế
bào già và chết [37]. Rút ngắn chiều dài telomere thƣờng dẫn đến sự mất ổn định hệ
gen, dẫn đến mất kiểm sốt chu kì tế bào, một dấu hiệu của ung thƣ. Sự rút ngắn
telomere đƣợc nghiên cứu là có liên quan tới việc tăng nguy cơ một số bệnh ung thƣ
của con ngƣời, bao gồm: bàng quang, phổi, thực quản, tụy, buồng trứng và tuyến
giáp [14], [17], [42], [60], [73]. Các tế bào chống lại sự rút ngắn này bằng cách sử
dụng một enzyme phiên mã ngƣợc gọi là telomerase.
Ở các lồi, các tế bào khác nhau thì chiều dài telomere là khác nhau, chiều
dài này phụ thuộc vào loại mô, độ tuổi và lịch sử nhân lên của tế bào. Chiều dài
telomere hai đầu nhiễm sắc thể thay đổi rõ rệt giữa các nhiễm sắc thể khác nhau
(Hình 1.1). Ví dụ NST 17p thƣờng có telomere ngắn hơn so với hầu hết các
telomere nhiễm sắc thể khác [58].

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

3


Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 1.1. Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau
Telomere được hiển thị màu vàng, DNA của nhiễm sắc thể hiện màu xanh [53].

Khi tế bào ở trạng thái không phân chia, tức là từ pha G2 trở đi, thì telomere
sẽ liên kết với một số loại protein gắn chuyên biệt lên các trình tự nằm ở ngay gần
vùng telomere nhằm tạo nên một cấu trúc phức tạp và vững chắc, đƣợc gọi là Tloop. Cấu trúc T-loop này đóng vai trò quan trọng bảo vệ đầu mút DNA nhiễm sắc

thể khỏi tác động của các enzyme hay các đáp ứng khơng thích hợp gây nguy hại
đến DNA, cũng nhƣ hiện tƣợng dung hợp các đầu mút nhiễm sắc thể hay hiện tƣợng
tái tổ hợp tƣơng đồng giữa các vùng temomere [26].
- Các protein quan trọng liên quan đến duy trì sự ổn định telomere và điều chỉnh
chiều dài telomere.
Cấu trúc T-loop của telomere liên quan tới các loại protein bám trên mạch:
+ POT1 (protection of Telomeres-1) khi hình thành cấu trúc T-loop, một đoạn
DNA phía dƣới vịng cung do DNA uốn lại, sẽ tách ra làm 2 mạch đơn, protein
POT1 bám vào mạch 3’, làm nhiệm vụ bảo vệ mạch và ngăn không cho 2 mạch bắt
cặp lại với nhau [56].
+ Các phức hợp TRF1 và TRF2 cùng với các protein tƣơng tác với chúng

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

4


Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 1.2. Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere [26].

+ Phức hợp protein TRF1 gồm TRF1, Tankyrase ½, PINX1, Tin2, và POT1, có
vai trị trong việc kiểm sốt sự tăng chiều dài telomere thơng qua việc tiếp nhận
telomerase lên telomere. Ngồi ra, cịn có các enzyme khác nhƣ Ku70/80, DNAPK, Bloom helicase [56], [78], [89].
+ Phức hợp protein TRF2 gồm TRF2, phức hợp (MRE11, RAD50, NBS1),
WRN, ERCC1/XPF, kết hợp với POT1 ngăn chặn sự bắt cặp giữa các đoạn cuối
NST với nhau. Ngoài ra, TRF2 cịn tƣơng tác với yếu tố phát tín hiệu sửa chữa NST
để bảo vệ telomere khỏi các enzyme sửa chữa [27].
1.1.2. Hoạt động telomerase ở người
Telomerase là ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere đầu cuối

của nhiễm sắc thể. Chúng hoạt động rất ít ở trong tế bào thƣờng, nhƣng hoạt động
phổ biến trong các dòng tế bào ung thƣ ngƣời và tìm thấy khoảng 85% các khối u
[47], [70]. Hoạt động của telomerase chống telomere rút ngắn trong quá trình sao
chép bằng cách tổng hợp DNA lặp lại telomeric mới ở đầu cuối nhiễm sắc thể.
Telomerase ở ngƣời là một phức hệ gồm hTR, hTERT. hTR (hoặc hTERC)
(human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human
telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc, giúp thêm telomeric

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

5


Luận văn thạc sỹ khoa học

lặp đi lặp lại đầu tận cùng nhiễm sắc thể [11], [87]. Cả hai hTR và hTERT đều biểu
hiện rất thấp ở tế bào thƣờng. Protein hTERT bao gồm 1132 axit amin đƣợc mã hóa
bởi gen hTERT nằm trên NST 5p15.33 [38], [59], [63]. Tổ chức gen hTERT có tổ
chức nhƣ sau:

Hình 1.3. Tổ chức gen của hTERT [23]

Gen hTERT ở ngƣời gồm 16 exon và 15 intron kéo dài hơn 40 kb [23], nằm
trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 5 (5p15.33), khoảng 2 Mb từ telomere và đƣợc
sao chép đến tâm động, miền sao đặc biệt của telomerase (T domain), miền reverse
transcriptase (RT domain).
Thành phần RNA của telomerase ngƣời có chừng 451 nucleotide (bao gồm
cả telomere CAAUCCCAAUC mẫu), mã hóa bởi gen hTR nằm trên NST 3q21-q28
[30]. Trong đó các nucleotide 46-56 là vị trí gắn vào đầu cùng 3’-OH của telomere.
Dựa trên quan sát thực nghiệm trong các ống nghiệm nuôi cấy tế bào và động vật,

các chất ức chế telomerase có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thƣ và di căn
[34], [40], [43].
Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng telomere là điều cần thiết cho sự tăng
trƣởng bền vững của các tế bào bất tử và hoạt tính này xảy ra ở hầu hết các khối u
ác tính [46], [77]. Gen hTERT hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ,

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

6


Luận văn thạc sỹ khoa học

không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma [59], [63], [64],
[79]. Khối u liên quan đến telomerase reverse transcriptase (hTERT) đƣợc biểu
hiện trên 85% khối u ở ngƣời [70]. Vì vậy kháng ngun này có thể là một cơng cụ
quan trọng để loại bỏ những tế bào mà không dễ dàng bị giết bởi điều trị thông
thƣờng. Việc ức chế hoạt động của telomerase trong các khối u dƣơng tính dẫn đến
telomere rút ngắn và tế bào chết bởi quá trình apoptosis [82].
1.1.3. Tình hình nghiên cứu hTERT
Ngay sau khi phát hiện nhiễm sắc thể của ngƣời có telomere ở 2 đầu, bao
gồm trình tự lặp đi lặp lại chuỗi TTAGGG [33], [48] Morin đã xác định đƣợc hoạt
động telomerase trong các tế bào của con ngƣời. Telomerase chỉ hoạt động trong
các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động ở tế bào soma [59], [63], [64],
[79]. Tuy số lƣợng tƣơng đối nhỏ các tế bào ung thƣ đƣợc xác định là không thể
hiện hoạt động của telomerase nhƣng vẫn duy trì chiều dài telomere [20].
Mặc dù tế bào ung thƣ cũng sinh ra cùng một mô nhƣng khơng giống nhƣ
các tế bào bình thƣờng, các tế bào ung thƣ có thể phân chia vơ hạn đến một khối
lƣợng đủ lớn gây nguy hiểm đến bệnh nhân. Nghiên cứu nhiều năm qua cho thấy
enzyme phiên mã ngƣợc ở ngƣời - hTERT có khả năng kích thích miễn dịch trong

cả ống nghiệm và trong cơ thể. Do vậy, hTERT có thể là mục tiêu đích điều trị ung
thƣ bằng miễn dịch [82].
Khơng phải tồn bộ phân tử kháng nguyên nhận diện và liên kết với kháng
thể hoặc TCR (T-cell receptor) mà chỉ có 1 phần nhất định của kháng nguyên gọi là
quyết định kháng nguyên hay còn gọi là epitope. Nghiên cứu trong nhiều năm qua
đã chứng minh các peptide có nguồn gốc từ hTERT đƣợc xử lý tự nhiên của các
khối u và trình diện trên phân tử MHC (major histocompatibility complex) và có thể
kích thích chức năng phản ứng của CTL (cytotoxic T lymphocyte). Peptide miễn
dịch đầu tiên đƣợc mô tả từ hTERT là I540 (ILAKFLHWL) đƣợc giới hạn trong
MHC lớp I alen HLA-A2. Chứng minh độc lập giữa các nhóm cũng thấy rằng TCR
(Tế bào lympho T gây độc) đáp ứng miễn dịch với peptide I540 trong ống nghiệm
có tác dụng diệt một loạt các dịng tế bào khối u hTERT+ [31], [85]. Trong giai

Hồng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

7


Luận văn thạc sỹ khoa học

đoạn gần đây, thử nghiệm đáp ứng miễn dịch hTERT đã đƣợc thực hiện ở một số
bệnh nhân ung thƣ vú hoặc ung thƣ tuyến tiền liệt, và thấy rằng phản ứng miễn dịch
và bằng chứng lâm sàng của các hoạt động chống khối u đƣợc quan sát thấy khơng
có độc tính [84]. Trong một thử nghiệm khác, với những bệnh nhân ung thƣ vú di
căn đã đƣợc tiêm vacxin dƣới lớp da với peptide I540 hTERT đƣợc nhũ hóa trong tá
dƣợc và đã phân tích cho thấy 68% bệnh nhân đã có phản ứng miễn dịch [88].
Ngồi epitope I540 cịn có các epitope- hTERT gây độc tế bào lympho T:
Bảng 1.1. hTERT- epitope gây độc tế bào lympho T [8], [83], [85]
Epitope


Trình tự

Phân tử hạn chế

I540

ILAKFLHWL

HLA-A2

R572

RLFFYRKSV

HLA-A2

D988

DLQVNSLQTV

HLA-A2

K973

KLFGVLRLK

HLA-A3

V324


VYAETKHFL

HLA-A24

Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện tạo vector tái tổ hợp mang gen mã
hóa peptide của epitope GV1001 (611-626) tƣơng ứng trình tự axitamin
EARPALLTSRLRFIPK của protein hTERT. Peptide GV1001 liên kết chặt chẽ
đồng thời với cả phân tử HLA lớp II và phân tử HLA lớp I trƣớc khi gắn vào các
APC, vacxin GV1001 gây đáp ứng đồng thời cả tế bào T hỗ trợ CD4 + và tế bào T
gây độc CD8+. Nhƣ vậy epitope GV1001 gây đáp ứng tự nhiên và đáp ứng đặc hiệu
[51]. Vì vậy, kháng ngun GV1001 có thể gây kích thích kháng thể hiệu quả đối
với các tế bào ung thƣ.
Trên thế giới GV1001 đã đƣợc thử nghiệm ở giai đoạn I/II các bệnh nhân
ung thƣ tuyến tụy, ung thƣ phổi và khối u ác tính đã đƣợc chứng minh rằng chủng
ngừa là an toàn và gây ra phản ứng miễn dịch ở 50-80% bệnh nhân đƣợc tiêm
phòng. Và GV1001 đang đƣợc nghiên cứu thử nghiệm giai đoạn III với ung thƣ
tuyến tụy [10], [15].

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

8


Luận văn thạc sỹ khoa học

1.1.4. Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT
Theo Hội Ung thƣ Việt Nam, bệnh nhân ung thƣ các loại đang gia tăng
nhanh chóng trong nhƣng năm gần đây. Mỗi năm có thêm 150.000 ngƣời mắc bệnh
ung thƣ. Do đó, ung thƣ là một trong nhƣng căn bệnh nan y gây nên tỷ lệ tử vong
cao nhất ở nƣớc ta nói riêng và trên thế giới nói chung. Vấn đề đặt ra là làm sao tìm

kiếm một loại vacxin phịng chống ung thƣ một cách hiệu quả. Một con đƣờng mới
đã mở ra đó là cách phịng bệnh ung thƣ bằng vật liệu di truyền hay vacxin DNA
đƣợc phát triển từ sự bùng nổ về công nghệ sinh học khi kỹ thuật DNA tái tổ hợp
đƣợc đƣa vào năm 1970. Vacxin DNA triển vọng sẽ ngăn chặn đƣợc căn bệnh thế
kỉ nhƣ: HIV, ung thƣ…, và những căn bệnh lây nhiễm quy mơ tồn cầu.
Hiện nay, vacxin có thể chia thành 5 loại: vacxin bất hoạt, vacxin sống giảm
độc, vacxin tiểu đơn vị (tiểu đơn vị, polysaccharides và tiếp hợp protein), toxoid
(biến độc tố) và vacxin DNA [6]. Trong đó vaccin DNA có rất nhiều ƣu điểm so với
các vacxin truyền thống về an toàn, dễ sản xuất và ổn định,... Thử nghiệm lâm sàng
cũng cho thấy vacxin DNA gây ít tác dụng phụ nhƣ mẩn đỏ, sƣng tấy, sốt và đau
đầu [19]. Hơn nữa, nó cũng đƣợc nghiên cứu là khơng gây tích hợp vào hệ gen [50].
Vacxin DNA bao gồm một DNA plasmid có chứa gen mã hóa trình tự của
một protein mục tiêu từ một tác nhân gây bệnh dƣới sự kiểm sốt của một promoter
nhân điển hình, cho phép biểu hiện protein trong các tế bào động vật có vú [25].
Bƣớc đầu tiên tạo vacxin DNA phải chọn vector plasmid phù hợp, yêu cầu cơ bản là
vector DNA plasmid có một promoter nhân chuẩn, một điểm khời đầu sao chép,
một chuỗi polyadenylate, một dấu chuẩn chọn lọc [35].
Mặc dù cơ chế miễn dịch của vacxin DNA trong tế bào vẫn chƣa rõ ràng, sự
gia tăng chậm các phản ứng miễn dịch sau đƣa DNA vào cho thấy nó theo một hành
trình phức tạp. Một plasmid chứa gen biểu hiện protein quan tâm dƣới sự kiểm soát
của promoter thích hợp đƣợc tiêm trực tiếp vào cơ thể qua da hoặc bắp cơ. Sau khi
plasmid đƣợc hấp thụ, protein nội sinh sẽ đƣợc sản sinh và một quá trình nội bào sẽ
biến nó thành một peptid kháng ngun. Ngồi ra, protein kháng nguyên có thể
đƣợc tiết ra trong và xung quanh các mơ bằng cách protein tiết hoạt tính hoặc giải

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

9



Luận văn thạc sỹ khoa học

phóng sau q trình apotosis của tế bào chuyển. Các peptid này sau đó đƣợc đƣa tới
lƣới nội chất. Trong lƣới nội chất nó đƣợc gắn với phân tử MHC-I (hệ thống trình
diện kháng nguyên). MHC-I sẽ trình diện peptid kháng nguyên trên bề mặt tế bào.
Tiếp theo CD8+ - tế bào T kết hợp với phức hệ phù hợp tạo thành CTR (tế bào
lympho T gây độc) chúng đƣợc gọi là tế bào miễn dịch trung gian. CTR kích thích
sản xuất Cytokin hoạt hóa tế bào B sản sinh kháng thể. Protein ngoại bào đƣợc trình
diện bởi MHC-II thơng qua APC (tế bào trình diện kháng nguyên) đƣợc CD4+- tế
bào T nhận biết dẫn đến kích hoạt tế bào B sản sinh kháng thể [50], [71].

Hình 1.4. Cơ chế vacxin DNA [41]

Sự biểu hiện của hTERT trong tế bào ung thƣ có liên quan sự tăng trƣởng,
phát triển khối u và sự biểu hiện của hTERT góp phần quan trọng đến sự biến đổi
ung thƣ bằng cách cho phép nhân tế bào lên không giới hạn. Ức chế hoạt động của
telomerase trong các tế bào khối u – hTERT hoạt động dẫn đến telomere rút ngắn
và tế bào chết bởi quá trình apotosis [36], [39]. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang
gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển
vọng. Tuy nhiên, một trong nhƣng mối đe dọa của vacxin DNA là nguy cơ hội nhập
trình tự một phần hoặc toàn phần plasmid vào hệ gen của vật chủ. Điều đó sẽ dẫn
đến đột biết gen, gây bất hoạt gen ức chế khối u hoặc kích thích gen gây ung thƣ

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

10


Luận văn thạc sỹ khoa học


hoặc gây mất ổn định nhiễm sắc thể. Tuy nhiên mối lo ngại trên thực nghiệm thấy
rằng tỷ lệ thâm nhập plasmid không đáng kể và thấp hơn so với tỷ lệ tự phát các đột
biến trong bộ gen động vật có vú [29]. Mối quan tâm nhất đối với vacxin DNA là
làm thế nào tăng khả năng hội nhập và duy trì plasmid DNA trƣớc khi biểu hiện
trong tế bào. Một vấn đề cần quan tâm nữa là tính lạ của DNA, có thể kích thích sản
xuất kháng thể chống lại DNA. Vì vậy, để tăng cƣờng quá trình chuyển DNA và
tăng hiệu quả của vacxin, cần phải chọn chất truyền trung gian tạo phức với DNA.
Chitosan là polymer có khả năng gắn kết với DNA và đƣợc báo cáo rằng có khả
năng bảo vệ DNA khỏi sự thủy phân của DNase. Do vậy, chitosan là chất dẫn
truyền gen hiệu quả. Ngoài ra chitosan khơng độc, có khả năng phân hủy sinh học
nên khơng gây dị ứng và không gây phản ứng phụ [13], [18], [72], [81].
1.2. Tổng quan về chitosan
1.2.1. Giới thiệu chung chitosan
Chitosan là một polysacarit mạnh thẳng, là dẫn xuất deaxetyl hóa của chitin,
trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C (2). Chitosan đƣợc cấu
tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết β(1-4) 2-amino2-deoxy-β-D-glucoranose.
Chitin là một chuỗi polymer dài bao gồm liên kết β(1-4) 2-acedamodo-2deoxy- β-D-glucose (N-acetylglucosamine), một dẫn xuất của glucose [74]. Đây là
polysaccharide có nhiều trong tự nhiên sau xenllulo và nó là thành phần chính của
thành tế bào của nấm, các khung xƣơng của động vật chân đốt nhƣ động vật giáp
xác và cơn trùng [62].

Hồng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

11


Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 1.5. Cấu trúc của chitin và chitosan [46].
Chitin và chitosan có giá trị kinh tế rất lớn vì chúng có các đặc tính sinh học

nhƣ: khơng độc, có khả năng phân hủy sinh học nên không gây dị ứng và không gây
phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trƣờng [13], [18], [72], [81]. Ngồi ra
chúng cịn có đặc tính kháng khuẩn, kháng vius nên chitin và chitosan đƣợc ứng
dụng rộng rãi trong y học và dƣợc học [44]. Ở pH <6.3 chitosan tích điện dƣơng. Vì
vậy, nó có thể tạo phức hợp với plasmid DNA và chitosan nhƣ một vật mang gen
hiệu quả [55]. Hầu hết các đặc tính đặc trƣng của chitosan có liên quan đến trọng
lƣợng phân tử của nó. So với chitosan, chitin là vật liệu khó hịa tan, nên ứng dụng
rất ít. Bằng việc thay đổi nhóm amin cho nhóm hydroxyl đã giúp chitosan hịa tan
trong nƣớc và dung mơi hữu cơ có thể đƣợc cải thiện. Trọng lƣợng phân tử trung
bình của chitin là 1,03 x106 đến 2,5x106 Dalton nhƣng chitosan thƣơng mại có trọng
lƣợng phân tử trung bình dao động từ 3800- 20.000 Dalton và deacetyl hóa là 6695%. Độ tan chitosan phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa, độ PH…. Chitosan dễ
dàng tan trong các dung dịch loãng hầu hết là các axit hữu cơ nhƣ citric, axit
tartaric, tan trong một số axit vô cơ [54].
Chitosan là chất rắn, màu trắng ngà, không mùi, không vị, khá ổn định trong
các dung dịch kiềm ngay cả ở nhiệt độ cao [46]. Chitin không tan trong nƣớc cũng
nhƣ hầu hết các dung môi hữu cơ. Ngƣợc lại chitosan tan tốt trong dung dịch acid
Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

12


Luận văn thạc sỹ khoa học

loãng (pH < 6,3) [21]. Ở pH < 6,3, chitosan tích điện dƣơng. Ngồi ra, chitosan có
những tính chất sau:
 Là hợp chất cao phân tử nên trọng lƣợng phân tử của nó giảm dần theo thời
gian do phản ứng tự cắt mạch. Nhƣng khi trọng lƣợng phân tử giảm thì hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm khơng bị giảm đi.
 Có thể tạo nhiều dạng sản phẩm nhƣ dạng miếng, bột mịn, hạt, màng, tấm
xốp, bơng, sợi, gel.

 Trong phân tử chitosan có chứa nhóm -OH, -NH2 trong các mắt xích Nacetyl-D-glucosamine có nghĩa chúng vừa có nhóm hydroxyl và nhóm amin nên dễ
dàng thay thế bằng các nhóm khác.
 Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer đƣợc nối với nhau bởi
các liên kết α-(1-4)-glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất nhƣ:
acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân.
 Hoạt tính sinh học: Vì khơng có tính kháng ngun nên chitosan có khả năng
tƣơng thích sinh học với các cơ quan, mơ và tế bào động thực vật. Ngồi ra, chúng
có tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kích thích q trình làm lành vết thƣơng và
đơng máu, có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể, có tác dụng
hỗ trợ trong điều hòa miễn dịch, chống loét, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm,
chống khối u… [66], [67].
1.2.2. Ứng dụng của chitosan
Trên thế giới, hầu hết những cơng trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục
đích chế tạo những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển
hƣớng đích thuốc trên những tế bào ung thƣ. Một số ứng dụng của chitosan trong
các lĩnh vực đời sống nhƣ:
Trong lĩnh vực y học, nhờ vào đặc tính khơng độc, tƣong thích với mơ cơ
thể, tự phân hủy đƣợc, nên chitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong kĩ
thuật bào chế dƣợc phẩm, làm da nhân tạo chữa bỏng, giảm đau, tá dƣợc ổn định
viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng. Hỗn hợp chitosan-collagen làm giảm
cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipit, đƣợc dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

13


Luận văn thạc sỹ khoa học

khuẩn, chỉ khâu trong phẫu thuật, điều trị suy thận, ung thƣ, kiểm soát virus AIDS

[22], [45] .
Trong công nghiệp, chitosan làm chất keo cảm quang, kem dƣỡng da, xà
phòng dầu gội đầu, nƣớc hoa. Trong công nghiệp nhuộm làm tăng độ màu vải
nhuộm. Trong công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, chất chống oxy hóa,
chất bảo vệ lạnh, chất tạo keo, chất phụ gia thức ăn cho cá, làm phụ gia thực phẩm
duy trì hƣơng vị tự nhiên, ổn định màu, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau quả
tƣơi, làm trong nƣớc quả ép, giữ màu sắc và hƣơng vị tự nhiên của sản phẩm [9],
[80].
Trong nông nghiệp, chitosan làm thuốc tăng trƣởng thực vật và kích thích
gây tạo kháng sinh thực vật, phân bón, thuốc diệt nấm bệnh cho thực vật, ngăn chặn
sự tăng trƣởng và phát triển cây ăn quả, làm bao bì bảo quản các thực phẩm và sản
phẩm nông nghiệp [9], [80].
Trong khoa học kĩ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuếch đại của kính
hiển vi, xử lý nƣớc thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein,
phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm, xác định chì trong mẫu nƣớc. Riêng trong cơng
nghệ sinh học chitosan đƣợc sử dụng rộng rãi làm vật mang gen và phân phối
vacxin DNA [21], [69], [80].
1.2.3. Giới thiệu chung về nano chitosan
Công nghệ nano (nanotechnology) là ngành công nghệ liên quan đến việc
thiết kế, phân tích chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc
điều khiển hình dáng, kích thƣớc trên quy mơ nano mét (nm). Ở kích thƣớc nano,
vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống khơng có đƣợc đó
là do sự thu nhỏ kích thƣớc và việc tăng diện tích mặt ngồi.
Chitosan đƣợc sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong
những năm gần đây vì những tính chất ƣu việt của nó ở kích thƣớc nano. Hạt nano
Chitosan trở thành vật liệu tiềm năng vận chuyển axit nucleic vào tế bào trong liệu
pháp gen. Hạt nano chitosan với tính năng nhƣ tính tƣơng thích sinh học, phân hủy
sinh học, bám dính màng và khơng độc hại, đặc biệt mang điện tích dƣơng nên có

Hồng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN


14


Luận văn thạc sỹ khoa học

khả năng thúc đẩy sự hình thành phức hợp với axit nucleic mang điện tích âm [12],
[24], [49].
Nano chitosan do có kích thƣớc siêu nhỏ (từ 10 đến 1000 nm) nên dễ dàng đi
qua màng tế bào, có thể đƣa vào cơ thể qua nhiều con đƣờng khác nhau nhƣ dùng
ngoài da, dùng qua đƣờng miệng, qua mũi… Nano chitosan có diện tích và điện tích
bề mặt cực lớn nên đƣợc ứng dụng nhiều trong sinh y học nhƣ mang thuốc, vacxin,
vector chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thƣ… Khi sử dụng nano
chitosan làm dẫn thuốc, thuốc điều trị đƣợc bảo vệ bởi những hạt nano chitosan
khỏi sự phân hủy sinh học. Do kích thƣớc rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm
sâu vào cơ thể, đƣa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị [81].
Trên thế giới, hầu hết những cơng trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục
đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát
triển chitosan hƣớng đích thuốc tới những tế bào ung thƣ. Một số cơng trình tiêu
biểu là điều chế hạt chitosan composite với acid polyacrylic để điều khiển và kéo
dài thời gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc
tới mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đƣờng
mũi; tạo phức với axit deoxylcholic để dẫn truyền gen [32]. Ngồi ra, nano chitosan
cịn đƣợc nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn, ứng dụng trong thực phẩm chức năng
[52], [86]. Nhiều cơng trình cũng nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bề mặt hạt nano
chitosan vì đây là đặc tính rất quan trọng quyết định hiệu quả gây nhiễm gen, gắn
kết các phân tử protein trên hạt nano. Tuy nhiên, các kết quả đạt đƣợc rất khác
nhau.
Ở Việt Nam, nano chitosan cũng bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu, đặc biệt trong
ngành thực phẩm chitosan đƣợc ứng dụng rất rộng rãi nhƣ bảo quản các loại hoa

quả, đồ đông lạnh, làm chất phụ gia [3], [4] … Ngoài ra, chitosan là một vật liệu
mới tiềm năng làm vật liệu phân phối vacxin DNA, chất hấp thụ trong dẫn truyền
thuốc, xử lý mơi trƣờng [1], [2], [65].

Hồng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

15


Luận văn thạc sỹ khoa học

1.2.4. Chitosan, chất mang dẫn truyền gen
Những hệ thống dẫn truyền gen không virus (non-virus) trong vật liệu gen đã
đƣợc đề xuất để thay thế những vector virus. Chúng làm giảm tối thiểu phản ứng
miễn dịch từ vật chủ. Hơn nữa, dễ sản xuất với lƣợng lớn và bảo quản đơn giản.
Những lợi thế này đã tạo động lực cho sự phát triển của chúng. Chitosanpolycation đƣợc nhận thấy là chất mang đầy hứa hẹn trong số những hệ thống dẫn
truyền gen không virus. Chất mang gen polymer nổi lên với hiệu quả chuyển gen,
xác định mục tiêu điều trị và khả năng tƣơng thích sinh học tốt.
Chitosan là một vector khơng virus thích hợp cho dẫn truyền gen. Tƣơng tác
giữa chitosan và DNA là tƣơng tác tĩnh điện [75]. Tƣơng tác mạnh đến mức phức
chitosan-DNA khơng bị tách cho đến khi nó vào trong tế bào. Chitosan và những
dẫn xuất chitosan tụ lại bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của DNase. Những hạt nano
chitosan/plasmid DNA có kích thƣớc từ 20-500 nm nhỏ hơn những hệ thống
polymer khác nên thâm nhập vào tế bào thuận lợi hơn cơ chế endocytosis, làm tăng
tốc độ gây nhiễm [75], [76].
Những hệ thống dẫn truyền gen dựa trên chitosan cũng có thể gắn thêm
ligand để có tƣơng tác tế bào cụ thể nhƣ transferrin hoặc galactose [28], [68].
Kết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể sống cho thấy khi hạt
nano chitosan/plamid DNA vào trong cơ thể chúng nhanh chóng di chuyển khỏi
máu và bám trên những cơ quan khác nhau. Kích thƣớc hạt khác nhau thì phân bố

trên những cơ quan khác nhau [57], [90]. Vì vậy, chitosan là vật liệu thích hợp để
dẫn truyền DNA trong sản xuất vacxin DNA.
1.2.5. Các phương pháp tạo nano chitosan
Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp tạo nano chitosan. Phƣơng pháp sử dụng
nhiều nhất là tạo gel ion, ƣu điểm của phƣơng pháp này là quá trình chuẩn bị đơn
giản và không cần sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó phƣơng
pháp này đƣợc nghiên cứu rộng rãi trong dẫn truyền thuốc và thực phẩm chức năng
[32].

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

16


Luận văn thạc sỹ khoa học

Những yếu tố ảnh hƣởng đến tính chất hạt nano chitosan nhƣ kích thƣớc hạt
và sự tích điện bề mặt là khối lƣợng phân tử và độ deacetyl hóa của chitosan. Sự lựa
chọn phƣơng pháp tổng hợp nano chitosan phụ thuộc vào bản chất của những phân
tử hoạt động cũng nhƣ những yêu cầu dẫn truyền khác nhau [32].
Hiện nay có 5 phƣơng pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan là: Phƣơng
pháp khâu mạch nhũ tƣơng (emulsion cross-linking), phƣơng pháp giọt tủa/kết tủa
(coacervation/precipitation), phƣơng pháp hợp nhất giọt nhũ tƣơng (emulsiondroplet coalescence), phƣơng pháp tạo gel ion (ionic gelation), phƣơng pháp mixen
đảo (reverse micellar) [7], [5].
a) Phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng
Hỗn hợp nhũ tƣơng nƣớc trong dầu (w/v) đƣợc tạo ra bằng cách phân tán
dung dịch chitosan trong dầu. Những giọt lỏng đƣợc làm bền bởi chất hoạt động bề
mặt. Dung dịch nhũ tƣơng sau đó đƣợc khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp
nhƣ glutaraldehyde. Hai nhóm –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –
NH2 của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan.


Hình 1.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng

Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

17


×