Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu xây dựng qui trình PCR đa mồi và chế tạo kít quy mô phòng thí nghiệm chẩn đoán Neisseriameningitidis, Haemophilus influenzae týp b, Streptococcus pneumoniae

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm màng não là một bệnh lý nhiễm trùng nghiêm trọng, tỷ lệ tử vong cao nếu
không được nghĩ đến, chẩn đoán và điều trị kịp thời. Viêm màng não do vi khuẩn là
bệnh nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương cấp tính với biểu hiện lâm sàng rất đa dạng
như: hội chứng màng não rầm rộ, sốt cao, dịch não tủy đục mủ, nhiễm khuẩn huyết...
Bệnh diễn biến nặng, nếu không được chẩn đoán, điều trị kịp thời có thể tử vong hoặc
để lại di chứng nặng nề như: hội chứng màng não, điếc, câm, mù, rối loạn tâm thần,
động kinh....[7]. Bệnh hay gây thành dịch, nhất là những nơi tập trung đông người thì
nguy cơ lây nhiễm là rất cao. Sự hiểu biết về các tác nhân gây bệnh thường gặp sẽ hỗ
trợ cho công tác điều trị và xây dựng các chương trình phòng chống bệnh tật tại từng
Quốc gia. Hầu hết những dữ liệu về dịch tễ của viêm màng não ở người lớn đều xuất
phát từ những quốc gia đã phát triển, trong đó 4 tác nhân cũng là nguyên nhân quan
trọng gây bệnh và tử vong trên thế giới: Streptococcus pneumoniae (phế cầu) 30 - 60%,
Neisseria meningitidis (não mô cầu) 13 - 37%, Listeria monocytogiens và
Haemophilus influenzae [34,18 ].
Những năm gần đây nhiều loại kháng sinh tốt đã được đưa vào sử dụng. Tuy
nhiên tỷ lệ tử vong trung bình ở nhiều nước trong vùng dịch tễ do màng não cầu 7 –
10%, phế cầu 30%, do Haemophilus influenzae là 10 – 14% [7].
Tại Việt Nam, những nghiên cứu về viêm màng não do H. influenza,
S. pneumoniae và N. meningitidis đối với người trưởng thành chưa nhiều, chủ yếu tập
trung ở đối tượng trẻ em. Thời gian gần đây những nghiên cứu dịch tễ học được mở

rộng trên các đối tượng, tuy nhiên chưa có thống kê cụ thể. Theo Lê Thanh Bình (Bệnh
viện Trung ương Huế) từ 1999 – 2001 có 65 trường hợp tỷ lệ tử vong (9%), tỷ lệ di
chứng 11%, nguyên nhân hàng đầu là H. influenza (35,3%), thứ đến là não mô cầu
(18,4%), phế cầu (9,2%). Nghiên cứu của Phạm Nhật An và cộng sự năm 2001 tại
Viện Nhi Trung ương với bệnh nhân từ 0 đến 15 tuổi được chẩn đoán là viêm màng
não với tỷ lệ H. influenzae (50%), S. pneumoniae (22,06%), N. meningitidis
(11,76%), Streptococcus (5,88%) và một số loại vi khuẩn khác.
Để chẩn đoán ca bệnh trước đây chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng, yếu
tố dịch tễ, xét nghiệm bằng kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy phân lập từ những mẫu
bệnh phẩm lâm sàng. Các kỹ thuật này có độ nhạy thấp, thời gian phân lập cần 481


72 giờ. Các kỹ thuật này không đáp ứng điều kiện chẩn đoán nhanh, điều trị kịp
thời, vì diễn biến của ca bệnh xảy ra rất nhanh (đặc biệt là não mô cầu từ khi xuất
hiện triệu chứng đầu tiên đến tử vong trung bình 18 giờ) [11 ].
Thử nghiệm ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên polysaccaride trong
bệnh phẩm máu, dịch não tủy... của H. influenza là 78 – 100%, đối với S.
pneumoniae là 67- 100% và N. meningitidis là 50 – 93%. Kỹ thuật này đơn giản,
chẩn đoán nhanh hơn kỹ thuật nuôi cấy (<15 phút). Tuy nhiên, kỹ thuật ngưng kết
latex đã xảy ra hiện tượng cho kết quả âm tính và dương tính giả [35], ngoài ra kỹ
thuật này chỉ dùng trong phát hiện ca bệnh.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex – PCR: mPCR)
dần được cải tiến và phát triển. Với mục đích khắc phục những nhược điểm của các
kỹ thuật trên và phát hiện cùng một lúc 3 tác nhân vi khuẩn trên cơ sở xác định các
gene đặc hiệu, nhằm hỗ trợ công tác điều trị đạt hiệu quả cao, giảm giá thành, thời
gian xét nghiệm, nâng cao chất lượng giám sát, tiên lượng nguy cơ bùng phát dịch
trước, trong và sau vụ dịch, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu xây dựng qui trình
PCR đa mồi và chế tạo kít qui mô phòng thí nghiệm chẩn đoán Neisseria
meningitidis, Haemophilus influenzae týp b, Streptococcus pneumoniae”
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:
- Xây dựng qui trình mPCR1 phát hiện N. meningitidis; H. influenzae týp b
và S. pneumoniae.
- Xây dựng qui trình mPCR2 phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A,
B, C.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1. 1.Tổng quan não mô cầu (Neisseria meningitidis)


1.1.1. Lịch sử
Viêm màng não do Neisseria meningitidis (não mô cầu) được Gaspard
Vieusseux mô tả kỹ từ vụ dịch viêm màng não ở Geneve vào mùa xuân năm 1805,
mặc dù từ thế kỷ thứ II trước công nguyên đã được đề cập. Năm 1884 Ettore
Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát được vi khuẩn trong tế bào ở
dịch não tủy. Năm 1887 Anton Weichselbaum phân lập được vi khuẩn gây bệnh từ
dịch não tủy của bệnh nhân và mô tả với cái tên là: Diplococcus intracellularis
meningitidis. Sau đó, năm 1901 Albrecht và Ghon đã đổi thành Neisseria
meningitidis để ghi công Albert Neisser – nhà khoa học người Đức[8,36].
1.1.2. Dịch tễ học
Dịch não mô cầu xảy ra tại các khu vực khác nhau trên thế giới. Tác
nhân gây bệnh có thể thay đổi tùy theo vùng địa lý, mùa, thời gian và độ tuổi. Hầu hết
nguyên nhân gây dịch ở Châu Phi là do nhóm huyết thanh A, mặc dầu vậy nhóm C,
W135 và X cũng đã được ghi nhận (Greenwood, 2007). Ở Châu Âu và các vùng
công nghiệp, nhóm B và C là nguyên nhân chính gây bệnh viêm màng não, trong đó
nhóm B thường gây bệnh ở người dưới 20 tuổi. Năm 2007, tỷ lệ tử vong là
1/100.000 dân, cao hơn ở Ireland và UK là: 3,8/100.000 và 2,5/100.000 dân (CDC,
2009). Theo Rosenstein NE, Perkins BA và cộng sự (1999) thì nhóm A và C thường
gây bệnh ở Châu Á và Châu Phi, nhóm C gây một số vụ dịch ở Canada, Mỹ (19921993) và Tây Ban Nha (1995-1997). Nhóm B gần đây gây dịch nhiều hơn ở Tân
Tây Lan với 500 trường hợp hàng năm. Vụ dịch lớn ở Trung Quốc năm 1979 - 1980
bắt nguồn từ phía Bắc sau đó lan đến phía Nam nước này và lan ra toàn cầu và
nguyên nhân là do não mô cầu nhóm A. Trong vài năm gần đây, nhiễm khuẩn não
mô cầu do nhóm Y và W135 có chiều hướng tăng lên. Israel và Thụy điển cũng
cung cấp các số liệu cho thấy sự gia tăng của nhóm Y. Theo CDC, tại Mỹ, các ca
bệnh do nhóm W135 đã tăng từ 4% lên 20% trong vòng 3 năm từ 1978 đến 1980;
đặc biệt nhóm W135 gây bệnh cho vài trăm người ở Arập Saudi (2000-2001), gây
dịch ở Burkina Faso (Châu Phi) làm chết hơn 1.500 người. Năm 1996, vụ dịch não
mô cầu lớn nhất trong lịch sử 100 năm đã xảy ra tại vùng ngoại ô Saharan - Châu
3


Phi với 152.813 người mắc và 15.783 người chết.
Tại Việt Nam vào năm 1939-1940 ở miền Bắc, có một vụ dịch lớn nhiễm
trùng huyết và viêm màng não do N. meningitidis lan từ Trung Quốc sang với số
bệnh nhân lên tới 7.000 người [22]. Sau năm 1941, miền Bắc vẫn còn thấy một số
vụ dịch nhỏ. Năm 1977 vụ dịch ở Thành phố Hồ Chí Minh có 1015 ca mắc, do N.
meningitidis nhóm C gây ra [5]. Theo tác giả Bùi Đại (2009), các nhóm huyết thanh
lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là nhóm huyết thanh A, B, C. Tuy nhiên, năm 2011
ghi nhận 1 trường hợp nhiễm nhóm W135 và một trường hợp đồng nhiễm cả B và
W135 tại Bắc Giang [9]. Giai đoạn từ 2001 – 2010, trung bình ghi nhận 650 trường
hợp mắc bệnh mỗi năm, chủ yếu ở các tỉnh khu vực phía Bắc. Năm 2012 ghi nhận
125 trường hợp mắc. Đầu năm 2013 vẫn có các trường hợp mắc rải rác tại nhiều
tỉnh, thành phố trong cả nước, nguy cơ lây lan trong cộng đồng là rất lớn [6]. Theo
Bộ Y tế, trong 6 tháng đầu năm 2015 cả nước ghi nhận 24 ca bệnh viêm màng não
do N. meningitidis, tăng 16 ca so với cùng kỳ năm ngoái. Trong đó riêng tháng 4, cả
nước ghi nhận 11 ca viêm màng não do não mô cầu, 2 ca tử vong.
N. meningitidis cư trú tại vùng họng mũi của người và lây truyền theo các
giọt nước nhỏ bài tiết qua đường hô hấp. Bệnh lây truyền trực tiếp do tiếp xúc gần
hay gián tiếp qua trung gian đồ dùng chung bị nhiễm khuẩn của bệnh nhân. Con
người là ký chủ tự nhiên duy nhất của não mô cầu, hiện nay chưa phát hiện có ký
chủ hay véctơ truyền bệnh nào khác. Thời gian ủ bệnh thường không xác định được
rõ và đã được ước tính trung bình từ 1 đến 10 ngày.
N. meningitidis có khả năng gây dịch lớn hoặc các trường hợp lẻ tẻ. Nhóm A
thường gây bệnh dịch lớn, xảy ra theo chu kỳ khoảng 20 - 30 năm hoặc dịch nhỏ có
chu kỳ 8 – 12 năm. Nhóm B và C thường gây các trường hợp riêng lẻ giữa thời gian
có dịch lớn, tuy nhiên vẫn có khả năng gây thành dịch lớn. Nhóm Y chỉ gây dịch
riêng lẻ trên trẻ em và thanh niên. Tuổi dễ mắc bệnh nhất là trẻ em từ 6 tháng đến 3
tuổi hoặc thanh thiếu niên từ 14 – 20 và tỷ lệ bệnh thấp ở người trên 20 tuổi. Tỷ lệ
người lành mang vi khuẩn chiếm khoảng 5 – 15%, tuy nhiên tỷ lệ này có thể dao
động và có mức độ cao hơn ở một số cộng đồng nhất định [5]. Bệnh thường xảy ra
ở nơi tập trung đông người (nhà trẻ, trường học, ký túc xá, doanh trại...), hay gặp
vào mùa đông - xuân.
4


1.1.3. Đặc điểm sinh học
 Hình thể
N. meningitidis là cầu khuẩn Gram âm, kích thước thay đổi, có thể thấy ở dạng đơn
độc hoặc song cầu hình hạt cà phê với hai mặt dẹt đối diện nhau, kích thước khoảng 0,8
- 1µm, đứng riêng rẽ từng đôi một hoặc nhiều đôi tụ thành đám và có thể nằm trong
hoặc ngoài bạch cầu đa nhân. Trên tiêu bản nhuộm từ môi trường nuôi cấy, não mô cầu
thường có hình thể đa dạng, to nhỏ khác nhau và cách sắp xếp không điển hình. Vi
khuẩn ở trong bệnh phẩm dịch não tủy thường có vỏ, không di động, không sinh nha
bào, bắt màu Gram (-), đa số các chủng đều có vỏ.

Hình 1.1: N. meningitidis dưới kính hiển vi điện tử. Nguồn: Internet.
 Tính chất nuôi cấy
N. meningitidis là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chỉ phát triển tốt ở môi trường
giàu chất dinh dưỡng như thạch máu, chocolate và khí trường có 5 – 10% CO 2,
nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 370C.
Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi, óng ánh và có màu hơi
xám. Sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính khoảng 1mm, không tan máu,
để lâu khuẩn lạc có màu xám đục và có thể làm màu môi trường ở dưới vùng nuôi
cấy vi khuẩn đậm.
Trên môi trường thạch chocolate, khuẩn lạc có dạng S, xám đục và óng ánh.

5


Hình 1.2: N. meningitidis trên môi

Hình 1.3: N. meningitidis trên môi

trường thạch chocolate. Nguồn CDC.

trường thạch máu. Nguồn CDC.

 Sức đề kháng
Cầu khuẩn N. meningitidis có sức đề kháng yếu: chỉ sống được trong bệnh
phẩm dịch não tuỷ 3 – 4 giờ sau khi ra khỏi cơ thể. Bị tiêu diệt ngay với tia cực tím,
dung dịch chloramin 0,5 – 1% hoặc cồn 700. Ở nhiệt độ 550C/30 phút hoặc ở
600C/10 phút não mô cầu cũng bị tiêu diệt. Không chịu được khô và ánh sáng. Các
thuốc sát trùng thông thường dễ tiêu diệt cầu khuẩn màng não. Ngoài ra vi khuẩn dễ
bị chết do men tự ly giải.
 Cấu trúc kháng nguyên [5, 8,31,36]
Màng tế bào chất
Khoảng gian màng
Màng ngoài tế bào

Protein màng tế bào chất
Por A

Lipooligosaccharide
Por B

Pili
Vỏ
Protein màng ngoài
Phospholipid

Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.
Nguồn: Nancy E. Rosenstein và cộng sự (2001) [31].
6


- Lớp polysaccharide (PS) nang: là kháng nguyên vỏ, có tác dụng tạo kháng thể
bảo vệ (ngoại trừ nhóm B). Căn cứ vào tính không đồng nhất về cấu trúc và tính
kháng nguyên của PS người ta đã tìm được 13 nhóm huyết thanh của cầu khuẩn
màng não bao gồm: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y, Z. Nhóm A chứa
mannosamine phosphate, trong khi đó nhóm B , C, Y, W135 chứa acid sialic - chất
đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và độc tính.
- Lớp lipo - oligosaccharide (LOS) – Endotoxin: Cấu tạo của LOS gồm 1
glycolipid màng ngoài nhưng thiếu các chuỗi O đặc trưng và hình thái “xù xì” (ráp)
tương tự như của LPS. Nó bao gồm 3 thành phần chính: oligosaccharide nhân; lipid
A kỵ nước (thành phần gây độc) và một chuỗi oligosaccharide nhánh có thể thay đổi
(thành phần tạo miễn dịch). Tính không đồng nhất về cấu trúc và tạo miễn dịch của
các chuỗi oligosaccharide nhánh (lgtA, lgtC, lgtD và lgtG), được sử dụng để phân
loại các chủng thành 12 type miễn dịch bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng.
Type miễn dịch L1 - L8 liên quan chi phối nhóm huyết thanh B, C; type miễn dịch
L9 - L12 liên quan đến nhóm A. Màng ngoài chứa hơn 50% LOS, nó tương tự như
polysaccharide của vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A.
- Lớp protein của màng ngoài (Por A và Por B): đặc hiệu type huyết thanh
(serotype) và phân type huyết thanh (serosubtype). Màng ngoài não mô cầu chứa một
số protein màng ngoài chính (OMPs): chức năng của Por B (tên trước đây là protein
lớp 2/3) và Por A (protein lớp 1) như porin, cho phép các chất dinh dưỡng đi vào. Hầu
hết độ lớn các kháng nguyên bộc lộ trên bề mặt tế bào não mô cầu và độ lớn của kháng
nguyên giữa các chủng là khác nhau, nên N. meningitidis được phân chia trên 20
serotype và serosubtype khác nhau chủ yếu ở nhóm B, C. Nhiều chủng phân lập không
thể phân loại được là serotype hay serosubtype nào bằng kháng thể đơn dòng hiện tại.
Cấu trúc kháng nguyên của type huyết thanh và phân type huyết thanh thay đổi in
vivo một cách nhanh chóng trên một cá thể người và trong cộng đồng. Sự thay đổi
này làm cho việc phát triển vắc xin mới là hết sức khó khăn.
Kháng nguyên X: kháng nguyên này chung với cầu khuẩn lậu cầu, phế cầu khuẩn.
Kháng nguyên này được dùng trong một số kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh.
1.1.4. Chẩn đoán [5]
a. Chẩn đoán ca bệnh lâm sàng
- Dựa vào yếu tố dịch tễ: Có tiếp xúc với bệnh nhân hoặc sống trong tập thể
(nhà trẻ, trường học, ký túc xá, doanh trại…) có người đã được xác định bị mắc
bệnh do não mô cầu.
- Dựa vào lâm sàng:
7


+ Thời kỳ ủ bệnh trung bình là 4 ngày (2-10 ngày).
+ Biểu hiện nhiễm trùng: Sốt cao đột ngột, ho, đau họng, mệt mỏi, nhức
đầu... Tình trạng nhiễm trùng nhiễm độc nặng (sốc), có thể tử vong nhanh trong
vòng 24 giờ
+ Dấu hiệu màng não - não: Đau đầu dữ dội, nôn, gáy cứng (trẻ nhỏ có thể có
tiêu chảy, thóp phồng và gáy mềm), rối loạn ý thức, kích thích vật vã, có thể có co
giật, hôn mê…
+ Ban xuất huyết hoại tử hình sao, xuất hiện sớm và lan nhanh.
b. Chẩn đoán xác định ca bệnh
- Là ca bệnh lâm sàng, có kèm theo xác định được vi khuẩn gây bệnh bằng
một trong các xét nghiệm sau:
+ Soi thấy song cầu gram (-), cấy phân lập được N. meningitidis trong dịch
não tủy.
+ Cấy máu phân lập được N. meningitidis.
+ Soi và cấy phân lập được N. meningitidis trong tử ban.
+ PCR (+) với N. meningitidis trong dịch não tủy, máu, tử ban.
 Kỹ thuật nhuộm soi
Bệnh phẩm là dịch não tủy (ly tâm lấy cặn nếu dịch não tủy trong) nhuộm gram,
soi trên kính hiển vi thấy hình ảnh song cầu gram (-) nằm trong và ngoài tế bào.

Hình 1.5: N. meningitidis nhuộm Gram từ dịch não tủy.
Nguồn: WHO [40].
 Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập
8


Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán não mô cầu là phân lập được N. meningitidis từ
dịch tiết vô trùng của cơ thể như: dịch não tủy, máu (lấy trước khi dùng kháng sinh),
được cấy trên môi thạch máu, môi trường Thayer - Martin cải tiến hoặc chocolate
(có bổ sung kháng sinh VCN) và được ủ ở 370C, 10% khí CO2. Chọn khuẩn lạc, thử
các tính chất sinh vật hoá học và ngưng kết với kháng huyết thanh để xác định
nhóm. Sự khác biệt với các vi khuẩn thuộc loài khác là khuẩn lạc được thử nghiệm
oxidase, catalase dương tính và thử nghiệm sinh hóa lên men. Cuối cùng là xác định
về huyết thanh nhằm xác định subgroup của N. meningitidis, đây là vấn đề quan
trọng trong giám sát dịch tễ học, phần này chỉ có thực hiện tại các phòng thí nghiệm
chuyên dụng.

Hình 1.6: N. meningitidis mọc trên thanh định danh API NH. Nguồn Internet.
 Kỹ thuật điện di miễn dịch: Phát hiện polysaccharide đặc hiệu của N.
meningitidis trong dịch não tuỷ, máu và nước tiểu. Kỹ thuật này có thể phát hiện được
polysaccharide ở mức 0,1µg/ml.


Kỹ thuật ngưng kết: Gắn anti-polysaccaride lên hồng cầu hoặc hạt latex để

phát hiện kháng nguyên polysaccaride của N. meningitidis trong bệnh phẩm máu,
dịch não tủy, nước tiểu, độ nhạy dao động từ 2,5 - 62,5 ng/ml (62,5ng/ml đối với N.
meningitidis nhóm B) và chỉ dùng trong phát hiện ca bệnh. Do đó Trung tâm kiểm
soát bệnh tật CDC khuyến cáo không sử dụng kỹ thuật này trong thường qui xét
nghiệm chẩn đoán nhiễm não mô cầu.

9


Hình 1.7: Bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.


Kỹ thuật sinh học phân tử
Phương pháp PCR, realtime PCR là công cụ tốt cho phát hiện tác nhân vi sinh

vật từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (dịch tiết, máu và dịch não tủy, dịch tử ban…) và
không cần thiết yêu cầu vi khuẩn phải sống trong mẫu bệnh phẩm (vi khuẩn chết,
hoặc đang bị ly giải do điều kiện bảo quản hoặc trước khi sử dụng kháng sinh). Cho
đến nay PCR đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và giám sát tác nhân vi sinh
vật vì nó có độ nhậy và độ đặc hiệu cao, nó chứng minh là công cụ bổ sung tốt cho
các phương pháp xác định kiểu hình như: nuôi cấy, nhuộm gram, và ngưng kết hạt
latex để nâng cao nhận định khẳng định kết quả. Kỹ thuật PCR rút ngắn thời gian
xét nghiệm còn khoảng 4 - 6 giờ, phù hợp với yêu cầu chẩn đoán nhanh trên đối
tượng bệnh nhân và điều tra người mang N. meningitidis trong vụ dịch. Tuy nhiên,
PCR không thể thay thế hoàn toàn được kĩ thuật nuôi cấy, phân lập thường qui.
Nuôi cấy, phân lập vừa tiêu chuẩn vàng vừa có thể giữ chủng não mô cầu, thử
nghiệm kháng sinh đồ, tuyển chọn chủng sản xuất vắc xin và thực hiện những
nghiên cứu chuyên sâu khác.
Một số gene đích xác định loài và nhóm N. meningitidis
Việc xác định N. meningitidis bằng kỹ thuật PCR tiêu chí được đặt lên hàng đầu
đó là lựa chọn các đoạn gene đặc hiệu và phù hợp, nhiều phòng thí nghiệm trên thế
giới sử dụng các đoạn gene đặc hiệu như ctrA, porA, crgA, sodC, IS1106... để phát
hiện loài N. meningitidis. Để phát hiện nhóm huyết thanh sử dụng gene sacD hoặc
Orf-2 cho phát hiện nhóm A, gene siaD cho phát hiện nhóm B và C.
Mỗi gen có vai trò và chức năng nhất định ví dụ: gene ctrA và sodC là hai
gene vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào. Gene ctrA là đoạn gene mã hóa protein
màng ngoài có tính bảo thủ cao, ít thay đổi cấu trúc và được tìm thấy trong tất cả
10


các nhóm huyết thanh. Gene sodC phát hiện khả năng hình thành vỏ của cầu khuẩn,
nó có vùng đặc hiệu cho não mô cầu trên người bệnh và nhất là ở người mang mầm
bệnh không triệu chứng mà ở đó không có gene ctrA và được tìm thấy trong N.
meningitidis nhưng không có trong loài Neisseria. spp [24]. Gene porA là một
protein màng ngoài có chức năng như một tế bào mitogen B hay các chất hoạt hóa,
và lipooligosaccharide (LOS), là tác nhân chính có chức năng nội độc tố
(Singleton et al., 2005), gene crgA thuộc vùng gene bảo thủ, gen này tham gia điều
tiết độ bám dính của N. meningitidis để bám dính vào tế bào vật chủ[28].

Sơ đồ 1.1: Bản đồ gene capsule (CPS) của N. meningitidis. Nguồn CDC.
1.1.5. Đáp ứng miễn dịch [1,4,36,41]
Kháng nguyên gây miễn dịch của N. meningitidis nhóm A, C là
polysaccharide vỏ và sẽ tạo kháng thể chuyên biệt là IgG hay IgM. Riêng đối với
nhóm B, kháng nguyên gây miễn dịch chưa được định nghĩa rõ ràng, có thể bao
gồm cả protein màng tế bào và chỉ tạo đáp ứng IgM đơn thuần. Kháng nguyên vỏ
của nhóm B trong chẩn đoán miễn dịch thường gây phản ứng chéo với vỏ E. coli
serotype K1 (hay gây viêm màng não ở trẻ nhỏ) .
Trẻ em mới sinh có thể có miễn dịch thụ động IgG do được mẹ truyền qua nhau
thai. Miễn dịch sau tiêm vắc xin thu được ở các mức độ khác nhau tùy theo nhóm.
1.1.6. Điều trị dự phòng [5]
- Sử dụng thuốc điều trị dự phòng càng sớm càng tốt, tốt nhất là trong vòng
24h. Sau khi có chẩn đoán xác định ca bệnh thì những người tiếp xúc gần sử dụng
một trong các loại kháng sinh: Ciprofloxacin, Rifampicin, Azithromycin.

11


- Những người có tiếp xúc mật thiết với bệnh nhân trong thời gian từ 7 ngày trước
ngày khởi phát cho đến 24 giờ sau khi bệnh nhân được dùng kháng sinh đặc hiệu.
- Hạn chế tối đa việc tiếp xúc với bệnh nhân và những người khác.
- Vệ sinh cá nhân, đảm bảo thông thoáng nhà cửa theo nguyên tắc phòng bệnh
qua đường hô hấp.
- Vắc xin phòng bệnh: Trên thị trường phổ biến có 3 loại vắc xin: loại chứa một
kháng nguyên (A hoặc C), chứa 2 kháng nguyên (A và C) và cả bốn kháng nguyên (A,
C, Y và W 135). Riêng đối với nhóm B trên thế giới chỉ có vắc xin sản xuất tại Cu Ba
đạt tiêu chuẩn đưa vào chương trình tiêm chủng thường xuyên cho trẻ em.
1. 2.Tổng quan Haemophilus influenzae
1.2.1. Lịch sử
H. influenzae đã được phân lập đầu tiên vào năm 1892 bởi Richard Pfeiffer
từ đờm của một bệnh nhân cúm và được gọi là Bacterial influenzae (vi khuẩn cúm).
Vi khuẩn này đã bị nhầm lẫn với bệnh cúm cho đến năm 1933 khi phát hiện ra virút
cúm là căn nguyên gây bệnh cúm, vai trò của H. influenzae mới được làm sáng tỏ.
Xuất phát từ yếu tố lịch sử và nhu cầu đòi hỏi những yếu tố phát triển có mặt ở máu
(heamophilus: ưa máu) nên vi khuẩn này có tên gọi H. influenzae , thuật ngữ này
được để nguyên trong y văn tiếng Việt [2].
1.2.2. Dịch tễ học
Vi khuẩn H. influenzae là một trong những loại vi khuẩn ký sinh ở đường
hô hấp người và một số loài động vật. Loài H. influenzae là căn nguyên của một số
bệnh nhiễm trùng ở người (viêm đường hô hấp, viêm màng não...).
H. influenzae týp b (Hib) đã được thế giới xác định là một trong những căn nguyên
chính gây viêm màng não do vi khuẩn, đặc biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [10]
Tại những nước phát triển như khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, châu Úc hầu hết
những nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mang Hib ở họng rất cao ở trẻ nhỏ, đặc biệt là
những trẻ được chăm sóc tại các các trung tâm giữ trẻ có thể mang Hib đến 15%
[10]. Trẻ bị bệnh viêm màng não nếu không được điều trị kịp thời có thể để lại
những di chứng nặng nề về thần kinh, khiến trẻ bị điếc, trí tuệ sa sút, mất khả năng
học tập, khó khăn khi vận động… Tỷ lệ tử vong có thể từ 5-10% đối với những trẻ
bị viêm màng não do Hib.
12


Trên thế giới, hàng năm, ước tính khoảng 8 triệu trường hợp viêm phổi, viêm
màng não mủ và khoảng 400.000 trẻ tử vong do Hib. Còn tại Việt Nam, theo thống
kê năm 2000 do WHO hợp tác với Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương tiến hành, ước
tính Hib gây ra 625 trường hợp VMN, 107.565 trường hợp viêm phổi nặng hàng
năm. Theo một nghiên cứu tại nội thành Hà Nội từ tháng 3/2000 - 2/2002: hàng
năm số mắc VMN do Hib khoảng 12/100.000 trẻ dưới 5 tuổi, với tỷ lệ tử vong 4%
và tỷ lệ di chứng 10%.
Vi khuẩn Hib tồn tại ở mũi và họng, dễ lây truyền từ người này sang người
khác qua đường hô hấp, qua những giọt nước bọt do hắt hơi vào ho. Người chưa có
miễn dịch phòng bệnh đều có nguy cơ cao mắc bệnh này, đặc biệt là trẻ từ 6 tháng
đến dưới 2 tuổi. Những người mang vi khuẩn Hib không có bất kỳ dấu hiệu, triệu
chứng nào của bệnh. Tuy nhiên, căn bệnh này hoàn toàn có thể phòng bằng tiêm vắc
xin sớm và đủ mũi cho trẻ dưới 6 tháng tuổi [14].
1.2.3. Đặc điểm sinh học [2, 13,14]


Hình thể
Hình thể điển hình của H. influenzae là cầu trực khuẩn nhỏ, Gram âm. Kích
thước 0,3 - 0,5 x 0,5 – 3,0 µm nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy
nhiên khi chúng ở dịch não tủy, hình thể của chúng có thể kéo dài ra gấp vài lần so
với chiều dài thông thường (vi khuẩn đa hình thái). Thường có vỏ, không có lông,
không sinh nha bào và không di động.

Hình 1.8: H. influenzae dưới kính hiển vi điện tử. Nguồn Internet.

Tính chất nuôi cấy
H. influenzae thuộc loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Là vi khuẩn khuyết dưỡng,
không phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường chỉ mọc khi môi
trường có sẵn cả hai yếu tố X và V.

13


H. influenzae hiếu khí, phát triển tốt hơn trong khí trường 5 – 10% CO 2. Mọc
tốt trên môi trường chocolate có Bacitracin và Levinthal ở nhiệt độ 37 0C, thời gian
18 – 24 giờ. Không mọc được trên thạch máu cừu, nếu mọc trên các loại thạch máu
khác (máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên
chocolate trong cùng điều kiện và thời gian nuôi cấy. Trên môi trường thạch máu có
thể thấy hiện tượng bội nhiễm của khuẩn lạc Staphylococcus aureus (do khả năng
tiết ra yếu tố V của S. aureus) còn môi trường này đã sẵn có yếu tố X.
Trên môi trường thạch, sau 16 – 18 giờ, H. influenzae phát triển thành khuẩn
lạc bóng mờ, vồng nhẹ, nhày ướt, óng ánh, không tan huyết, có mùi hăng đặc biệt
(hăng idol), đường kính 1 - 2 mm, khi có ánh sáng chiếu vào có đường kính lớn
hơn. Sau 24 giờ trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly
giải và tính chất bắt màu Gram thay đổi.
Trên môi trường lỏng, H. influenzae làm đục môi trường. Tình trạng mất vỏ
xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch.

Hình 1.9: H. influenzae trên môi

Hình 1.10: H. influenzae thử

trường thạch chocolate. Nguồn CDC.
nghiệm yếu tố X, V. Nguồn CDC.
 Sức đề kháng
H. influenzae là vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh.
Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp,
để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này dễ
dàng. Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán H. influenzae nên được vận chuyển về
phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt (trong vòng 1 giờ hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt
độ phòng). Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi trường vận chuyển, bảo
quản 4 – 80C tối đa 24 giờ.
 Cấu trúc kháng nguyên
14


H. influenzae có nhiều loại kháng nguyên như kháng nguyên vỏ, kháng
nguyên vách, kháng nguyên pili…Tuy nhiên H. influenzae được phân thành 2
nhóm: loại không vỏ polysaccharide (không xác định được týp huyết thanh) và loại
có vỏ (xác định được týp huyết thanh). Loài có vỏ được phân loại theo các týp huyết
thanh từ a đến f tùy thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ do gene qui định.
Trong đó týp b thường gặp và có vai trò gây bệnh quan trọng. Các gene mã hóa cho
việc tổng hợp kháng nguyên này nằm trên một phức hợp transposon (gen nhảy). Vỏ
bọc týp b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là
polyribosyl – ribitol – phosphate (PRP). Những polysaccharide bề mặt có liên quan
chặt chẽ với độc lực của vi khuẩn, đặc biệt Hib nguyên nhân của nhiễm trùng hệ
thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng não (chiếm trên 90%).
Kháng nguyên pili và các protein bám dính giúp vi khuẩn bám vào tế bào
cơ thể chủ. Pili giúp vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp. Ngoài pili,
bốn yếu tố bám dính có bản chất protein là Hap, HMW1, HMW2 và Hia/Hsf. Sự
phân bố của các yếu tố bám dính có sự khác nhau tùy theo từng chủng.
1.2.4. Chẩn đoán [2,13]
a. Chẩn đoán lâm sàng
Trên lâm sàng, viêm màng não do Hib có thể tiến triển âm ỉ trên vài ngày,
thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc đột ngột tiến triển trong
vài giờ.
Những dấu hiệu không đặc hiệu: sốt, ngủ gà, suy hô hấp, rối loạn tâm thần,
dấu hiện Brudzinski, Kernig, co giật... Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu, cứng
gáy, sợ ánh sáng.
b. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Hiện nay, bên cạnh phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống thì những
phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian trả lời kết quả
nhanh cũng được áp dụng để phát hiện Hib trong chẩn đoán viêm màng não.
 Kỹ thuật nhuộm soi
Nhuộm soi có giá trị chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như vi khuẩn khác gây viêm
màng não mủ. Lấy cặn ly tâm dịch não tủy làm tiêu bản nhuộm Gram. Nếu là viêm
màng não mủ do H. influenzae sẽ thấy các cầu trực khuẩn Gram âm to nhỏ không
15


đều, rải rác có thể thấy các vi khuẩn dài mảnh. Trên vi trường còn thấy nhiêu bạch
cầu đa nhân.

Hình1.11: H. influenzae dưới kính hiển vi. Nguồn Internet.
 Kỹ thuật nuôi cấy phân lập
Loại bệnh phẩm tùy theo bệnh. Đối với nhiễm khuẩn đường hô hấp bệnh
phẩm thường là đờm, dịch họng mũi, dịch phế quản hoặc dịch não tủy... thì cấy trên
môi trường thạch chocolate có bổ sung Bacitracin (nồng độ 300µg/ml), đặt vào tủ
ấm 370C với 5 – 10% CO2. Sau 18 – 24 giờ chọn khuẩn lạc nghi ngờ, nhuộm soi
xem hình thể và tính chất bắt màu, tiếp theo làm các thử nghiệm sinh hóa và kháng
huyết thanh để phân biệt capsule polysaccharide (serotype) và phân biệt giữa
H. influenzae b với loài không tạo vỏ.
Mặc dù có tính đặc hiệu cao, nhưng phân lập H. influenzae gặp khó khăn, do
sử dụng kháng sinh trước khi thu thập mẫu bệnh phẩm sẽ làm giảm tỷ lệ phân lập
được bởi vi khuẩn sẽ bị diệt trước khi được xác định. Mặt khác H. influenzae rất
yếu, bất kỳ sự thay đổi nào trong qui trình nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ phân lập. Đối
với các nước đang phát triển phòng thí nghiệm còn nghèo nàn dẫn đến kết quả phân
lập không cao đối với H. influenzae.
 Kỹ thuật điện di miễn dịch
Còn được gọi là chẩn đoán Rapis test (RDT), kỹ thuật này đã được phát triển
để thử nghiệm trực tiếp kháng nguyên trong mẫu DNT mà không cần giai đoạn ủ
nhiệt và ly tâm, cho kết quả nhanh nhưng độ nhạy thấp thường cho kết quả âm tính
giả do nồng độ vi khuẩn trong mẫu xét nghiệm thấp.
 Kỹ thuật ngưng kết
Kỹ thuật ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong
DNT. Nguyên lý của phản ứng này là phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide

16


của Hib trong DNT bằng kháng thể đơn giá kháng vỏ đặc hiệu với Hib được gắn lên
bề mặt hạt latex.
Thử nghiệm ngưng kết hạt latex (LAT) là một kỹ thuật có độ nhậy phát hiện
H. influenzae hơn nuôi cấy, phân lập, bởi vì kỹ thuật này phát hiện kháng nguyên,
không cần vi khuẩn sống, kết quả này không bị ảnh hưởng của kháng sinh sử dụng
trước đó. Tuy nhiên, thử nghiệm nhậy cảm kháng sinh là không thể thực hiện được
bằng thử nghiệm LAT, do đó vấn đề nuôi cấy vẫn là hết sức cần thiết.
 Kỹ thuật sinh học phân tử
Có thể dùng phản ứng khuếch đại gene PCR, realtime - PCR để phát hiện
AND đặc trưng của H. influenzae trong bệnh phẩm. Phương pháp này có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao, thời gian trả lời kết quả nhanh.
Một số gene đích phát hiện H. influenzae
Các gene hpd mã hóa protien D có tính bảo thủ cao, bản chất là
Lipoprotein bao phủ bề mặt tế bào vi khuẩn và nó có ở cả chủng encapsule và
nonencapsule [25,26], tính bảo thủ hiển nhiên của gene này có trong toàn bộ chủng
Hi, đó là lý do sử dụng gene này trong việc định loại đặc hiệu loài trong các thử
nghiệm PCR. Hiện nay phát triển thường quy gene hpd trong phản ứng PCR xác
định 6 serotype (a-f) và nontypeable (HiNT) có độ nhậy và độ đặc hiệu cao.
Multiplex - PCR và realtime – PCR sử dụng gene đích là bexA đã được phát triển
xác định 6 serotype của Hi. Tuy nhiên, độ nhậy phát hiện với Hib kém hơn so với
Hia,Hic, và Hid và không phát hiện được Hie, Hif, hoặc HiNT.
Capsule của 6 serotype của Hi (Hia,b,c,d,e và f) bao gồm 3 vùng mã hóa
chức năng để tổng hợp capsule polysaccharide (25,43,44). Gene bexD;C;B;A trong
vùng ATP (vùng I) mã hóa protein cho ATP. Gene hcsA và hcsB trong (vùng III),
tương tự lipA và lipB ( hiện nay gọi tên là ctrE và ctrF) (43), hai vùng này quyết
định toàn bộ serotype. Vùng đặc hiệu serotype (trước đây gọi là vùng II) bao gồm
các gene tổng hợp capsule và đặc trưng cho mỗi serotype. Những gene đặc hiệu cho
serotype có tên là asc,bcs.

17


Sơ đồ 1.2: Capsule của H. influenzae serotypes a, b, c, d, e, và f bao gồm những
đoạn gene đặc hiệu cho serotype. Nguồn CDC.
1.2.5. Đáp ứng miễn dịch [2,14]
Miễn dịch tự nhiên của cơ thể đối với Hib rất đa dạng, bao gồm sự hợp tác
phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch. Mặc dù đặc điểm miễn
dịch tự nhiên đối với vi khuẩn Hib là miễn dịch đáp ứng với vài loại kháng nguyên
bề mặt, song kháng thể kháng polysaccharide vỏ thuộc týp b (PRP) có tầm quan
trọng nhất. Tuy nhiên kháng nguyên vỏ của Hib lại không nhận biết bởi đại thực
bào và tế bào lympho T nhưng lại kích thích các dạng tế bào lympho B đặc hiệu. Vì
vậy, kháng nguyên vỏ của Hib sẽ bị hạn chế về khả năng đáp ứng miễn dịch, không
hoạt hóa được các tế bào lympho T hỗ trợ đặc hiệu nên đáp ứng miễn dịch sẽ thấp.
Kháng thể kháng vỏ có hiệu lực bảo vệ cơ thể. Trẻ em nhận được kháng thể
kháng vỏ từ mẹ, hiệu giá kháng thể ở mức độ cao trong khoảng thời gian hai tháng
đầu sau đó giảm dần.
1.2.6. Điều trị dự phòng [2]
Các nhóm kháng sinh trước đây hay dùng để điều trị H. influenzae như
Ampicillin, Choloramphenicol hiện nay hầu như đã không còn hiệu lực với vi
khuẩn. Hiện nay các thuốc hay được dùng để điều trị vi khuẩn là các
Cephalosphorin thế hệ 3. Trong các trận dịch có thể dùng kháng sinh phòng ngừa là
Rifampicin.
Phòng bệnh không đặc hiệu:
+ Cách ly bệnh nhân. Nâng cao thể trạng.
+ Dùng kháng sinh dự phòng cho người lành có nguy cơ cao.
18


Phòng bệnh đặc hiệu:
+ Vắc xin thế hệ thứ nhất: chế từ vỏ polysaccharide của vi khuẩn týp b.
Nhược điểm của vắc xin này là tính sinh miễn dịch kém.
+ Vắc xin thế hệ thứ hai: là một vắc xin cộng hợp (conjugate vacxin), kháng
nguyên polysaccharid của vỏ được gắn vào một protein mang, vì vậy tính sinh miễn
dịch của polysaccharide được tăng cường. Thuốc có hiệu quả bảo vệ cao hơn ở trẻ
em trên 2 tuổi, dưới tuổi này vắc xin kém hiệu quả.
1.3. Tổng quan Streptococcus pneumoniae
1.3.1. Lịch sử:
Streptococcus pneumoniae (phế cầu khuẩn) được phân lập lần đầu bởi
L. Pasteur ở Pháp năm 1880, đồng thời với Stenberg, Mỹ. Ban đầu nó được mang
tên Micrococcus pasteuri. Mười năm sau, người ta thấy nó có liên quan đến viêm
phổi thùy, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết… Vi khuẩn này là tác nhân quan
trọng gây viêm phổi nên được gọi Pneumococcus. Hình thể là song cầu, gram
dương, thường quan sát thấy trong đờm nên đến năm 1926 vi khuẩn này được gọi
tên Diplococcus pneumonia. Trong môi trường lỏng, thường xếp thành chuỗi ngắn
do đó năm 1974 tên gọi lại được thay đổi Streptococcus pneumoniae và giữ nguyên
cho đến nay.
S. pneumoniae đã được biết đến là phế cầu có độc tố chịu nhiệt khi tiêm vi
khuẩn đã bất hoạt bằng nhiệt vẫn gây chết chuột, đây là yếu tố độc lực của phế cầu
khuẩn. Năm 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty chứng minh
nhân tố biến đổi là DNA, không phải protein ở S. pneumoniae.
1.3.2. Dịch tễ học [14,CDC-trevelers’]
Streptococcus pneumoniae là một thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn chí
vùng hầu họng. Bệnh phế cầu khuẩn xảy ra trên toàn thế giới. Bệnh phổ biến hơn ở
các nước đang phát triển. Tuy nhiên, tỷ lệ người lành mang phế cầu thay đổi tùy
theo tuổi, môi trường sống, mùa và sự có mặt của nhiễm trùng đường hô hấp trên, tỷ
lệ trung bình dao động từ 25 – 70 % dân số. Bệnh do S. pneumoniae phổ biến trong
mùa đông xuân nhưng xảy ra quanh năm ở các vùng nhiệt đới. Phế cầu là căn
nguyên hàng đầu của “viêm phổi mắc phải ở cộng đồng” (viêm phổi thùy và tiểu
thùy, xấp xỉ 500.000 trường hợp viêm phổi xảy ra hàng năm ở tất cả các lứa tuổi ở
Mỹ. Theo số liệu điều tra của một số nghiên cứu tại Việt Nam thời gian 1990 – 2003
19


cho thấy 40 – 70% trẻ khỏe mạnh mang phế cầu vùng hầu họng và 26 – 83% các
trường hợp viêm đường hô hấp cấp tính có nguyên nhân là phế cầu. Phế cầu là căn
nguyên chủ yếu của viêm tai giữa, viêm xoang ở trẻ em và là căn nguyên của viêm
màng não ở người lớn. Một số người có nhiều khả năng bị mắc bệnh với bệnh phế
cầu khuẩn. Nhóm có nguy cơ cao này bao gồm người lớn từ 65 tuổi trở lên và trẻ
em dưới 2 tuổi. Từ khi có kháng sinh, tỷ lệ chết của tất cả các bệnh phế cầu đã giảm
từ 30 xuống 15% nhưng tỷ lệ này lại lên đến 70% ở những bệnh nhân 70 tuổi hoặc
già hơn, mặc dù đã được điều trị.
1.3.3. Đặc điểm sinh học của Streptococcus pneumoniae [3,14]
 Hình thể
S. pneumoniae là những cầu khuẩn dạng ngọn nến, thường xếp thành đôi, ít khi
đứng riêng lẻ, đường kính khoảng 0,5 – 1,25µm. Trong môi trường lỏng, chúng thường
xếp thành chuỗi ngắn (dễ nhầm với liên cầu). Phế cầu Gram dương, không di động,
không sinh nha bào, trong bệnh phẩm hay môi trường nhiều albumin thì có vỏ.
S. pneumoniae khi phát triển trên môi trường nuôi cấy nhân tạo có các dạng:
+ Pneumococci dạng S (smooth) có bề mặt khuẩn lạc nhẵn, tròn, kích thước 1mm,
mặt bóng hơi lõm được tạo nên bởi những vi khuẩn có vỏ và có khả năng gây bệnh.
+ Pneumococci dạng R (rough) là những phế cầu bị mất vỏ polysaccarit (có
thể do điều kiện nuôi cấy không đủ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoặc nuôi cấy
trong một thời gian dài), tạo nên những khuẩn lạc có bề mặt sần, bờ không đều, mặt
gồ ghề, khô...những phế cầu này ít có khả năng gây bệnh.
Dạng S có thể biến thành dạng R, mất vỏ và mất khả năng gây bệnh. Ngược
lại dạng R có thể biến thành dạng S khi cho vào môi trường nuôi cấy chất ADN của
dạng S.

Hình 1.12: S. pneumoniae dưới kính hiển vi điện tử. Nguồn Internet.
 Tính chất nuôi cấy
20


Trong môi trường lỏng phế cầu mọc có khuynh hướng khuếch tán và lắng
cặn khi môi trường đã ngả sang axít. Vi khuẩn mọc dễ dàng trong các môi trường có
nhiều chất dinh dưỡng. Trên môi trường thạch (thạch máu cừu hay thỏ), vi khuẩn có
khuẩn lạc tròn bóng ướt do có vỏ, không sắc tố, có khuynh hướng lõm ở giữa vì sự
hoạt động của một enzyme tự ly giải, xung quanh khuẩn lạc có quần tan huyết
anpha.
S. pneumoniae phát triển tốt trong các môi trường lỏng và trên các môi
trường thạch Tryptocasein soya có bổ sung 5% máu (cừu, ngựa, thỏ) đã lấy hết tơ
huyết. Không nên dùng máu người vì thường có chất kháng sinh và các chất ức chế
vi khuẩn phát triển. S. pneumoniae phát triển tốt trong khí trường có 5% CO 2 ở
370CC, nếu không có tủ ấm CO2 có thể dùng chuông thủy tinh kín và đốt nến.

Hình 1.13: S. pneumoniae trên môi trường thạch máu. Nguồn CDC.
 Sức đề kháng
Dễ bị tiêu diệt bởi hóa chất thông thường và nhiệt độ (60 0C trong 30 phút).
Phế cầu không chụi được nhiệt độ quá lạnh hoặc quá nóng.
 Cấu tạo kháng nguyên
Trên 90 týp huyết thanh của phế cầu đã được ghi nhận bởi kháng nguyên vỏ
polysaccharide vỏ. Phế cầu có ba loại kháng nguyên: kháng nguyên R hiểu biết về
kháng nguyên này còn ít, polysaccharide C là kháng nguyên đặc hiệu loài (như với
liên cầu) và kháng nguyên M là những protein đặc hiệu týp. Kháng nguyên quan
trọng, độc lập về miễn dịch và đặc hiệu týp là polysaccharide vỏ.
- Phức hợp polysaccharide vỏ S. pneumoniae có thành phần là: glucose, 2–
acetaminido–2, 4, 6–trideoxy galactose, galactosamine, ribitophosphat và
cholinphosphat. Mặc dù người ta đã biết rõ thành phần cấu tạo, nhưng cấu trúc của
nó chỉ được xác định trong các týp 3, 6 và 8. Ví dụ týp 3 là sự trùng hợp của các
đơn vị acid cellobiuronic (D-acid glucoronic nối với D-glucose) gắn bởi 1-3
21


glucosidic. Kháng nguyên vỏ có vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của phế
cầu, những chủng không có vỏ không có khả năng gây bệnh.
- Phản ứng chéo: mặc dù kháng nguyên vỏ polysaccharide là khá đặc hiệu
týp nhưng một số có phản ứng chéo giữa các với một số loại vi khuẩn khác như
Klebsiella, Salmonella.
1.3.4. Chẩn đoán [3,14]
 Kỹ thuật nhuộm soi
Xét nghiệm trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít có giá trị trong
việc xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và cũng có thể đó chỉ
là vi khuẩn chí. Bệnh phẩm là máu, dịch não tủy hay dịch cơ thể mới có giá trị trong
chẩn đoán. Nhuộm Gram tiêu bản đờm cũng có giá trị xác định căn nguyên khi số
lượng tế bào bạch cầu đa nhân tăng lên. S. pneumoniae thường xếp đôi hình mắt
kính hay ngọn nến, cũng có thể đứng đơn lẻ tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương.
Tính bắt màu Gram dương có thể bị mất do bệnh phẩm để quá lâu, môi trường
không đủ chất dinh dưỡng hay bệnh nhân đã dùng kháng sinh.

Hình 1.14: S. pneumoniae dưới kính hiển vi. Nguồn Internet.
 Thử nghiệm “Quellung”
Phản ứng “Quellung” dương tính xảy ra khi kháng thể đặc hiệu loài (type
specific antiserum gắn với thành phần polysaccharide của vỏ phế cầu, gây nên sự
thay đổi chỉ số khúc xạ của vỏ khi ánh sáng chiếu vào mà ta nhìn thấy dễ dàng dưới
dạng “phình vỏ”. Hình ảnh quan sát thấy tế bào bắt màu xanh đen, xung quanh tế
bào có một một quầng với đường viền sắc nét, đó là gờ ngoài của vỏ (do ánh sáng
xuyên qua vỏ sáng hơn vùng tế bào). Bằng thử nghiệm này S. pneumoniae có thể

22


xác định trực tiếp từ dịch não tủy, dịch phúc mạc, dịch hút nội khí hoặc đờm hay từ
một khuẩn lạc đơn.
 Nuôi cấy phân lập
Đây là phương pháp tốt nhất để xác định phế cầu gây bệnh. Bệnh phẩm có
thể lấy từ họng mũi bằng bằng tăm bông mềm hoặc máu hoặc chất hút từ phổi...
Bệnh phẩm là dịch hầu họng, dịch phế quản được cấy vào môi trường thạch máu có
Gentamicin (4µg/ml). S. pneumoniae có khuẩn lạc dạng S, nhày, đường kính 1 –
2mm, có chóp và tan máu anpha. Sau 18 giờ hình chóp mất dần và khuẩn lạc trở
nên lõm xuống (phân biệt với các liên cầu tan máu anpha khác).
Để xác định độc lực của vi khuẩn (phân biệt với kí sinh trùng) thường phải
tiêm vi khuẩn vào phúc mạc chuột bạch, chuột chết phân lập lại vi khuẩn từ máu
tim của chuột. Nếu phân lập được vi khuẩn thì chắc chắn là phế cầu có độc lực.

Hình1.15: S. pneumoniae tự tiêu sau 18 giờ. Nguồn CDC.
 Thử nghiệm Optochin (nhạy cảm với Optochin) và thử nghiệm tan trong
muối mật (Bile solubility)
Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt
khoanh giấy optochin d = 6mm (chứa 5µg chất ethylhydrocupreine) lên vùng đã cấy
vi khuẩn, ủ 35-37OC/5% CO2. Quan sát sau 16-24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy
không có vòng vô khuẩn có nghĩa đó chỉ là viridans streptococci, nếu có vòng vô
khuẩn với đường kính ≥ 14mm là dương tính (vi khuẩn được thử là phế cầu), nếu
vòng vô khuẩn từ 9-13mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật.
Thực hiện trực tiếp thử nghiệm tan trong muối mật với khuẩn lạc nghi ngờ
ở trên thạch máu, phải sử dụng dung dịch sodium deoxycholate 10%, đọc kết quả
sau 15-20 phút nếu là phế cầu khuẩn, khuẩn lạc sẽ biến mất hoặc dẹt hẳn xuống do

23


bị ly giải, trong khi khuẩn lạc khác thuộc nhóm liên cầu nhưng không phải phế cầu
không bị tan trong dung dịch muối mật.

Hình 1.16: S. pneumoniae với thử nghiệm optochin phía bên phải đĩa thạch. Nguồn CDC.
 Kỹ thuật điện di miễn dịch và ngưng kết latex
Vỏ phế cầu có thể xuất hiện trong quá trình gây nhiễm khuẩn huyết, viêm
màng não mủ hoặc gây viêm phổi. Có thể tìm thấy kháng nguyên bằng các kỹ thuật
này. Độ nhạy và đặc hiệu của hai kỹ thuật đạt trên 90% với bệnh phẩm là dịch não
tủy hoặc nước tiểu. Có thể xác định nhanh polysaccharide C bằng miễn dịch sắc ký
với bệnh phẩm là dịch não tủy hoặc nước tiểu, độ nhạy >80%, độ đặc hiệu >90%.
 Kỹ thuật sinh học phân tử
Genome của S. pneumoniae có cấu trúc DNA vòng, gồm 2,0 -2,1 triệu bp
(phụ thuộc vào chủng), nó có 15.453 gene và thêm 154 gene tạo ra yếu tố độc lực,
176 gene không mã hóa kiểu hình, các loại gene này có thể thay đổi khoảng 10%
giữa các chủng. Kỹ thuật PCR, multiplex - PCR xác định serotype của
S. pneumoniae xác định được khoảng 40 serotype đặc hiệu [33], trong đó sử dụng 9
phản ứng đã được mô tả trên :www.cdc.gov/ncidod/ biotech/strep/PCR.htm.
Một số gene đích phát hiện S. pneumoniae
Phát hiện S. pneumoniae bao gồm các thử nghiệm PCR thông thường thiết kế
trên hai gene đích đặc hiệu để phát hiện S. pneumoniae: pneumolysin (Ply) và
autolysin (lytA) là gene mã hóa kháng nguyên bám dính bề mặt (psaA) [15]. Tuy
nhiên kết quả dương tính giả với ply đã được báo cáo khi xét nghiệm với mẫu bệnh
phẩm đường hô hấp trên, ở một số Streptococci tan máu alpha [29,37], đó là các vi
khuẩn đường hô hấp như: S. mitis, S. oralis chúng cùng có gene ply tương tự. PCR
đặc hiệu loài phát hiện S. pneumoniae sử dụng gene lytA có tính bảo thủ cao trong

24


loài và phân tách được S. pneumoniae với genotype tương tự như S. mitis, S. oralis
và S. pseudopneumoniae [30].
1.3.5. Đáp ứng miễn dịch
Trong thế kỷ 19, đã chứng minh rằng có đáp ứng miễn dịch bảo vệ trên thỏ,
diệt được phế cầu khuẩn. Thế kỷ 20, hiệu quả đáp ứng miễn dịch đã được chứng
minh ở Nam Mỹ. Một điều khám phá ra rằng capsule của S. pneumonia
polysaccharide kháng lại thực bào của tế bào bạch cầu và đến năm 1920 đã chỉ ra
kháng thể đặc hiệu kháng capsule polysaccharide diệt được S. pneumoniae. Năm
1936, vắc xin thành phẩm là capsule polysaccharide được sử dụng để khống chế
dịch phế cầu. Năm 1940, thử nghiệm biến đổi capsule bởi DNA như là vật liệu
mang mã hóa thông tin.
Năm 1990, xác định các serovar khác nhau của phế cầu khuẩn và đáp ứng
miễn dịch bảo vệ giữa các serovar. Đến nay xác định được trên 90 serovar. Không
phải toàn bộ các serovar đều gây bệnh, mà chỉ có một số serovar chủ yếu, do đó vắc
xin hiện nay bao gồm 23 serovar. Serovar được phân loại theo hai hệ thống: Hệ
thống Mỹ là số serovar theo thời gian phát hiện; Hệ thống Danish theo nhóm kháng
nguyên tương tự nhau.
1.3.6. Điều trị và dự phòng
Trong suốt thời gian dài kháng sinh điều trị thuộc nhóm kháng sinh βlactam. Những năm 1960, hầu hết các chủng S. pneumoniae nhậy cảm với
Penicillin, nhưng sau thời gian này sự kháng Penicillin đã trở nên phổ biến, đặc biệt
ở những vùng sử dụng liều cao và rộng rãi. Tỷ lệ biến đổi của các chủng kháng lại
Cephalosporin, Erythromycin, Tetracycline, Clindamycin và Quinolones. Các chủng
kháng lại Penicillin thì hầu hết kháng lại các loại kháng sinh khác. Hầu hết các
chủng còn nhậy cảm với Vancomycin.
Ở người lớn hiện nay sử dụng nhóm Fluoroquinolones như: Levofloxacin và
Moxifloxacin.
Hiện nay có 2 loại vắc xin đó là vắc xin polysaccharide và vắc xin
Conjugated. Vắc xin Polysaccharide vắc xin hầu hết đã được sử dụng, bao gồm việc
tinh sạch polysacharide từ 23 serotype (1, 2, 3, 4, 5, 6b, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A,
12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, và 33F). Đáp ứng miễn dịch qua tế
25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×