Tải bản đầy đủ

(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu đặc điểm kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THANH VIỆT

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ
GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2020


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………


NGUYỄN THANH VIỆT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ
GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã sỗ: 9 42 01 07

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Nghiêm Ngọc Minh
2. PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy

Hà Nội – 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có
nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên
cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách
quan. Các kết quả nghiên cứu này đã được công bố trên các tạp chí quốc
tế và tạp chí chuyên ngành trong nước với sự đồng ý của các đồng tác giả.
Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào của
tác giả khác.
Tác giả luận án

Nguyễn Thanh Việt


Lời cảm ơn
Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin cảm ơn GS. TS. Nghiêm
Ngọc Minh, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hệ gen và PGS. TS. Võ Thị
Bích Thủy, Phó Trưởng phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền
đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Ban Giám
đốc Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng


đã tạo điều kiện cho tôi được học tập tại Học viện Khoa học và Công nghệ,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo
điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại viện. Cảm ơn TS. Nguyễn Thị
Thanh Ngân, chuyên viên đào tạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi hoàn
thành những thủ tục cần thiết trong quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Khoa học và Công
nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Đào tạo, Học
viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học.
Tôi xin cảm ơn Khoa xét nghiệm, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác,
Học viện Quân y đã giúp tôi thực hiện một số thí nghiệm trong quá trình thực
hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn TS. Moreland Gibbs, Trung tâm hỗ trợ phần mềm
Genenious, New Zealand, đã giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích số liệu. Cảm
ơn các đồng nghiệp đã đóng góp, giúp đỡ tôi hoàn thiện luận án của mình.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người bạn thân
thiết đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thanh Việt


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt Viết đầy đủ

Tên tiếng việt

AM

Ampicillin

BHI

Brain Heart Infusion Broth

C

Chloramphenicol

CAZ

Ceftazidime

CIP

Ciprofloxacin

DNA

Deoxyribonucleic Acid

Axit đêôxiribônuclêic

RNA

Ribonucleic Acid

Axit ribônuclêic

GN

Gentamycin

GI

Genomic Island

KSĐ

Canh thang BHI

Kháng sinh đồ
Độ dài contig dài nhất

LCS

Longest Contig Size

LPS

Lipopolysaccharide

MDR

Multidrug Resistance

Đa kháng kháng sinh

MSS

Mean Sequence Size

Kích thước trung bình của trình tự

NC

Number of Contigs

Số lượng các contig

NGS

Next Generation Sequencing

Giải trình tự thế hệ mới

OMP

Outer Membrane Protein

Protein màng ngoài

R

Resistant

Đề kháng

S

Sensitive

Nhạy cảm

STR

Streptomycin

SCS

Shortest Contig Size

SXT

Sulfamethoxazol/Trimetoprim

TE

Tetracycline

Độ dài contig ngắn nhất


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các từ viết tắt
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella....................................................... 3
1.1.1. Hình thái .......................................................................................... 3
1.1.2. Tính chất nuôi cấy ........................................................................... 3
1.1.3. Tính chất hóa sinh ........................................................................... 4
1.1.4. Sức đề kháng .................................................................................... 4
1.1.5. Kháng nguyên .................................................................................. 4
1.1.5.1. Kháng nguyên O ......................................................................... 5
1.1.5.2. Kháng nguyên H ......................................................................... 5
1.1.5.3. Kháng nguyên Vi......................................................................... 6
1.1.6. Phân loại .......................................................................................... 6
1.2. Đặc điểm hệ gen của Salmonella .......................................................... 8
1.2.1. Cấu trúc hệ gen ................................................................................ 8
1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella ....................................... 10
1.2.2.1. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside ..................... 11
1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam ................................ 12
1.2.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol ................................. 13
1.2.2.4. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone............................... 13
1.2.2.5. Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline ...................................... 13
1.2.2.6. Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim ............................ 14


1.2.3. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi
khuẩn ........................................................................................................ 15
1.2.4. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc ................................ 15
1.2.4.1. Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc ................................... 16
1.2.4.2. Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở
Salmonella ............................................................................................. 18
1.3. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong
thực phẩm ................................................................................................... 19
1.3.1. Trên thế giới ................................................................................... 19
1.3.2. Tại Việt Nam .................................................................................. 22
1.4. Một số kỹ thuật hay được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen
...................................................................................................................... 23
1.4.1. Reverse transcription PCR (RT-PCR) .......................................... 24
1.4.2. Real-time PCR (qPCR) .................................................................. 24
1.4.3. Microarray...................................................................................... 24
1.4.4. Giải trình tự thế hệ mới ................................................................. 26
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 28
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................ 28
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................... 28
2.1.2. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit .............................. 29
2.1.2.1. Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO
6579:2002 .............................................................................................. 29
2.1.2.2. Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ ................................... 33
2.1.2.3. Kháng sinh ................................................................................ 34
2.1.2.4. Các bộ kít .................................................................................. 34
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ........................................................................ 35
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 37
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ................................................................. 37
2.2.2. Định danh Salmonella ................................................................... 37
2.2.2.1. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc ............................................... 37


2.2.2.2. Tăng sinh chọn lọc .................................................................... 37
2.2.2.3. Quy trình khẳng định ................................................................ 38
2.2.3. Kháng sinh đồ ................................................................................ 41
2.2.4. Giải trình tự thế hệ mới ................................................................. 42
2.2.4.1. Tách chiết, tinh sạch RNA tổng số và thiết lập thư viện cDNA 42
2.2.4.2. Giải trình tự thế hệ mới bằng công nghệ Illumina ................... 42
2.2.5. Nhóm phương pháp tin sinh học .................................................. 43
2.2.5.1. Kiểm tra chất lượng trình tự ..................................................... 43
2.2.5.2. Lọc trình tự chất lượng cao bằng phần mềm Trimmomatic [57]
................................................................................................................ 43
2.2.5.3. Lắp ráp de novo ........................................................................ 43
2.2.5.4. Chú thích hệ gen biểu hiện ....................................................... 44
2.2.5.5. Xác định các gen kháng kháng sinh ......................................... 44
2.2.5.6. Xác định đột biến gen kháng kháng sinh .................................. 44
2.2.6. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger ................................................................. 45
2.2.7. Xử lý thống kê ................................................................................ 45
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 46
3.1. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu ... 46
3.1.1. Kết quả phân lập Salmonella ........................................................ 46
3.1.2. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập được 56
3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được ............................................................................................................. 59
3.2.1. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được .......................................................................................................... 61
3.2.2. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân
lập.............................................................................................................. 63
3.2.3. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập
................................................................................................................... 65
3.2.4. Kiểu hình kháng kháng sinh ......................................................... 66


3.3. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa
kháng kháng sinh ....................................................................................... 69
3.3.1. Số lượng trình tự đọc (read) .......................................................... 71
3.3.2. Lắp ráp de novo .............................................................................. 72
3.3.3. Chú thích chức năng các gen........................................................ 73
3.3.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu ... 74
3.3.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh ..................................................... 74
3.3.4.2. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone .................... 87
3.3.4.3. Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux
pump) ..................................................................................................... 90
3.3.4.4. Nhóm gen độc lực ..................................................................... 97
3.3.4.5. Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar ............................. 99
3.3.4.6. Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp Lipopolysaccharide
(LPS) và thành tế bào .......................................................................... 101
3.3.4.7. Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc................................ 102
3.3.4.8. Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage................ 105
3.3.4.9. Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC ..................... 107
3.4. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger ................................................................. 110
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 114
Kết luận ........................................................................................................ 114
Kiến nghị ...................................................................................................... 114
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................... 115
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ........................................................................................... 116
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 117
PHỤ LỤC ................................................................................................... 1
Phụ lục 1. Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện cDNA bằng máy
Bioanalyzer. ................................................................................................ 1
Phụ lục 2. Gen độc lực biểu hiện ở các mẫu nghiên cứu. .......................... 4


Phụ lục 3. Biểu hiện của các gen liên quan đến flagellar ........................ 14
Phụ lục 4. Các gen tổng hợp LPS và thành tế bào ................................... 16
Phụ lục 5. Các gen liên quan đến các yếu tố di truyền vận động, phage, và
prophage. ................................................................................................... 18
Phụ lục 6. Các gen liên quan đến tác động bất lợi của môi trường biểu
hiện ở cả 6 mẫu nghiên cứu. ..................................................................... 20


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 1.1. Các gen kháng tetracycline [17] ..................................................... 14
Bảng 1.2. Hệ thống kênh bơm thải thuốc và cơ chất ở Salmonella ................ 17
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu, số mẫu và ký hiệu mẫu..................................... 28
Bảng 2.2. Thành phần các môi trường và hóa chất sử dụng để định danh
Salmonella ....................................................................................................... 29
Bảng 2.3. Thành phần môi trường BHI .......................................................... 33
Bảng 2.4. Thành phần môi trường Muller Hinton .......................................... 34
Bảng 2.5. Kháng sinh sử dụng làm kháng sinh đồ.......................................... 34
Bảng 2.6. Giải thích kết quả các phép thử khẳng định. .................................. 41
Bảng 2.7. Điểm phred và độ chính xác của trình tự [56] ................................ 43
Bảng 3.1. Kết quả tăng sinh sơ bộ không chọn lọc và tăng sinh chọn lọc 90
mẫu nghiên cứu ............................................................................................... 47
Bảng 3.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của 25 chủng vi khuẩn
mọc được trên các môi trường tăng sinh chọn lọc .......................................... 49
Bảng 3.3. Kết quả phân lập các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên cứu .... 53
Bảng 3.4. Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella ............................. 54
Bảng 3.5. Kết quả định danh type của các chủng Salmonella ở các mẫu
nghiên cứu ....................................................................................................... 57
Bảng 3.6. Mức độ đề kháng kháng sinh của Salmonella phân lập được ........ 61
Bảng 3.7. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân
lập .................................................................................................................... 64
Bảng 3.8. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập ... 65
Bảng 3.9. Kiểu hình kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được ................................................................................................................. 66
Bảng 3.10. Danh sách Salmonella đa kháng kháng sinh ................................ 68
Bảng 3.11. Nồng độ RNA tổng số của các mẫu nghiên cứu. ......................... 70
Bảng 3.12. Tóm tắt số lượng trình tự RNA của Salmonella ........................... 71
Bảng 3.13. Kết quả lắp ráp de novo hệ gen biểu hiện của các Salmonella..... 72


Bảng 3.14. Trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu ........................................... 74
Bảng 3.15. Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng
kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu ................................................................... 75
Bảng 3.16. Kết quả chi tiết các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở các mẫu
nghiên cứu. ...................................................................................................... 79
Bảng 3.17. Kết quả xác định đột biến gen kháng kháng sinh nhóm quinolone
......................................................................................................................... 87
Bảng 3.18. Kết quả xác định biểu hiển các gen liên quan đến kênh bơm thải
thuốc ở các mẫu nghiên cứu ............................................................................ 91
Bảng 3.19. Các gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC. .......................... 108


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 1.1. Kháng nguyên của Salmonella [4]. ................................................... 4
Hình 1.2. Phân loại Salmonella [6]. .................................................................. 7
Hình 1.3. Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8]. 9
Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen của S. Gallinarum [9]. ............................................. 9
Hình 1.5. Các kênh bơm thải thuốc ở Salmonella [23]................................... 17
Hình 3.1. Vi khuẩn từ mẫu TB-1 trên môi trường MSRV.............................. 47
Hình 3.2. Vi khuẩn từ các mẫu TL-1, 2, và TG-1 trên môi trường thạch XLD
......................................................................................................................... 48
Hình 3.3. Vi khuẩn từ các mẫu TB-1 và TL-1 trong thạch Kligler ................ 50
Hình 3.4. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TB-1 trong môi trường ure .......... 51
Hình 3.5. Vi khuẩn lập được từ mẫu TB-1, TL-1, 2 trong môi trường LDC . 52
Hình 3.6. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TL-2 trong môi trường VP .......... 52
Hình 3.7. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TL-1 trong môi trường Indol....... 53
Hình 3.8. Hình ảnh kháng sinh đồ của một số chủng Salmonella nghiên cứu.
......................................................................................................................... 60
Hình 3.9. Hình ảnh điện di các mẫu RNA tổng số trên gel agarose 0,8%...... 71
Hình 3.10. Heatmap của các gen độc tố biểu hiện ở 6 mẫu nghiên cứu. ........ 97
Hình 3.11. Cấu trúc flagellar của vi khuẩn [129]. ........................................ 100
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen parC ................................. 111
Hình 3.13. Kết quả phân tích sự sai khác nucleotide ở gen parC................. 112
Hình 3.14. Kết quả thay đổi amino acid ở các mẫu nghiên cứu ................... 112


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ

Trang

Biểu đồ 3.1. Số lượng các serovar phân lập được từ 3 nguồn thịt .................. 58


MỞ ĐẦU
Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng gây ra do các bệnh từ
thực phẩm là rất lớn. Theo đó, mỗi năm cứ khoảng 10 người thì có 1 người bị
bệnh. Bệnh từ thực phẩm có thể tiến triển nghiêm trọng, đặc biệt là đối với trẻ
nhỏ, người già và người bị suy giảm miễn dịch. Trong số các bệnh do thực
phẩm gây ra thì tiêu chảy là phổ biến nhất do sử dụng thực phẩm không an toàn,
khoảng 550 triệu người bị bệnh này mỗi năm, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới
5 tuổi. Salmonella là một trong 4 nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên
toàn cầu. Salmonella có khoảng hơn 2500 serovar khác nhau và có mặt ở khắp
mọi nơi. Tất cả các type huyết thanh của Salmonella đều có khả năng gây bệnh
cho người.
Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella đang tăng lên nhanh chóng
và trở thành mối đe dọa lớn tới sức khỏe loài người. Salmonella kháng kháng
sinh gây khó khăn cho việc kiểm soát nhiễm khuẩn, dự phòng và điều trị bệnh.
Do vậy, việc phân lập và xác định đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella
từ thực phẩm là việc làm cần thiết. Việc nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh
của Salmonella sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc dự phòng, kiểm soát
bệnh tật cũng như kiểm soát ô nhiễm thực phẩm và quy định sử dụng kháng
sinh trong điều trị và chăn nuôi nhằm hạn chế khả năng kháng kháng sinh của
vi khuẩn.
Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào dịch
tễ học kháng kháng sinh của các chủng Salmonella. Nghiên cứu chuyên sâu ở
mức độ phân tử về Salmonella ở Việt Nam còn chưa nhiều. Nghiên cứu các
nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh giúp hiểu biết sâu về
dịch tễ học phân tử các gen kháng kháng sinh. Quan trọng hơn là có thể phát
hiện được các đột biến mới ở gen kháng kháng sinh gây ra tính kháng kháng
sinh ở Salmonella. Ngoài ra còn có thể tìm ra các nhóm gen mới có khả năng
gây nên tính kháng kháng sinh ở loài vi khuẩn này.
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào về phân
tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập được
1


từ thực phẩm bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Theo tổ chức Nông lương
Liên Hiệp Quốc, Việt Nam là quốc gia có lượng tiêu thụ thịt bò, thịt lợn, và thịt
gia cầm tăng lên rất nhanh kể từ năm 1993 trở lại đây. Trong đó lượng thịt lợn
tiêu thụ trên đầu người tăng 3 lần, lượng thịt bò tăng lên 6 lần và thịt gia cầm
tăng gấp 7 lần khi so sánh lượng thịt tiêu thụ giữa năm 2015 và năm 1993.
Lượng thịt tiêu thụ này được dự báo là sẽ tăng lên đáng kể trong những năm
tiếp theo. Vì vậy, luận án: "Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen
liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng" đã được thực hiện với mục tiêu
và nội dung sau:
Mục tiêu:
1. Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, và thịt gà
tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội.
2. Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được.
3. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.
Nội dung nghiên cứu:
1. Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập được ở các
chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella.
2. Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng
Salmonella đa kháng kháng sinh.
3. Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh
để phân tích các nhóm gen liên quan. Xác nhận một số kết quả bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
Salmonella được phân lập lần đầu tiên từ ruột lợn rừng năm 1884 bởi
Salmon. Vào thời điểm đó, loài vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus
choleraesuis. Tên này sau đó được thay đổi thành Salmonella Choleraesuis bởi
Lignières vào năm 1900 khi ông tìm cách đặt tên cho nhóm vi khuẩn gây bệnh
tiêu chảy ở lợn. Tên này cũng được sử dụng bởi Buchanan năm 1918 khi ông
nghiên cứu loài vi khuẩn thuộc giống Salmonella, có tính chất sinh hóa như
glucose dương tính, lactose âm tính, sinh acid và CO2. Cũng trong những năm
1900, một vài loài Salmonella quan trọng được phát hiện và nghiên cứu gồm S.
Typhosum (sau này được đặt tên là Typhimurium), Paratyphosum A và B
(Paratyphi A và B). Ở thời kỳ đó, hai loài S. Gallinarum và S. Typhimurium
được nghiên cứu và chỉ ra vai trò gây bệnh của chúng ở người và động vật đã
được công nhận rộng rãi. Cho đến năm 1960 tên Salmonella, dùng để chỉ loài
vi khuẩn đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae mới được chấp nhận và sử dụng
rộng rãi trên thế giới [1].
1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella
Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và
động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày
ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại [2].
1.1.1. Hình thái
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0
µm, có nhiều lông quanh thân (trừ S. Gallinarum và S. Pullorum). Hầu hết
Salmonella đều di động được. Salmonella không có vỏ, không sinh bào tử [2].
1.1.2. Tính chất nuôi cấy
Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí. Phát triển được trên các môi
trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC. Salmonella có thể
sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5 và pH thích hợp là 6,5-7,5 [1]. Trên môi
trường thích hợp khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm.
Salmonella có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như
DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên
3


môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ (ngoại trừ loại
không có xylose hoặc không khử carbonyl của lysine), ở giữa có màu đen
(ngoại trừ loại không sinh H2S) [2].
1.1.3. Tính chất hóa sinh
Salmonella có lactose âm tính, glucose dương tính và thường sinh hơi,
đa số có sucrose âm tính, salicin âm tính, inositol âm tính, citrate dương tính ở
môi trường Simmons. Salmonella có catalase dương tính, oxidase âm tính,
lysine decarboxylase dương tính. Hầu hết sinh H2S, không sinh urease, lipase,
và deoxyribonuclease.
Không phải tất cả các Salmonella đều có đầy đủ tính chất trên. Ví dụ, S.
Typhi có glucose âm tính, không sinh hơi và citrate Simmons âm tính. Hầu hết
các S. Paratyphi A và S. Choleraesuis không sinh H2S. Khoảng 5% các
Salmonella có khả năng sinh bacteriocin kháng lại E. coli, Shigella và một số
Salmonella khác [2].
1.1.4. Sức đề kháng
Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh. Chúng có khả năng sống
trong môi trường khô. Trong rác thải, chúng có khả năng sống nhiều năm. Một
vài loài có khả năng sống nhiều tuần trong môi trường có 20% muối.
Salmonella nhạy cảm với nhiệt độ, chúng có thể bị tiêu diệt từ 70oC trở lên [3].
1.1.5. Kháng nguyên
Salmonella có 3 loại kháng nguyên được trình bày trong hình 1.1.

Hình 1.1. Kháng nguyên của Salmonella [4].
Chú thích: ba loại kháng nguyên của Salmonella là kháng nguyên thân
O, kháng nguyên lông H, và kháng nguyên Vi. Kháng nguyên Vi có thể bao phủ
kín kháng nguyên O, kháng nguyên này chỉ có ở S. Typhi và S. Paratyphi C.
4


1.1.5.1. Kháng nguyên O
Kauffmann và White là những nhà khoa học đã nghiên cứu một cách hệ
thống cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella. Có khoảng gần 70 yếu tố kháng
nguyên O khác nhau. Mỗi type huyết thanh mang một số yếu tố kháng nguyên
khác nhau. Kháng nguyên O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS) của màng
ngoài tế bào Salmonella. Kháng nguyên này có khả năng chịu nhiệt và là nội
độc tố của vi khuẩn, đóng vai trò gây bệnh. Dựa vào kháng nguyên O,
Salmonella được chia thành các nhóm huyết thanh từ A đến Z [2].
Mỗi kháng nguyên O gồm từ 5 đến 6 đơn vị đường, sự biến đổi ở các
đơn vị đường, liên kết cộng hóa trị giữa chúng và liên kết giữa các tiểu đơn vị
kháng nguyên O tạo ra các kháng nguyên O khác nhau [1].
Kháng nguyên O ở Salmonella có thể được chia thành hai nhóm chính.
Nhóm một gồm có các phân tử đường N-acetylglucosamine hoặc Nacetylgalactosamine và nhóm hai gồm có phân tử đường galactose trong cấu
trúc. Trong những năm gần đây, người ta đã xác định được 21 cấu trúc hóa học
và trình tự của 28 nhóm gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một.
Hiện tại, đã xác định được cấu trúc hóa học và trình tự các gen mã hóa cho 46
kháng nguyên O của Salmonella. Cấu trúc hóa học và các gen mã hóa cho
kháng nguyên O thuộc nhóm một có tính đa dạng cao [5].
1.1.5.2. Kháng nguyên H
Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. Gallinarum và S.
Pullorum. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc
kép. Những Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp
kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động. Một số Salmonella có
kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép, khi nuôi cấy trong môi trường có
kháng huyết thanh tương ứng với một kháng nguyên thì Salmonella vẫn di động
và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Ví dụ S. Paratyphi B có
kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép là đặc hiệu b và đặc hiệu 1, 2. Nếu
nuôi trong môi trường có huyết thanh kháng cả hai đặc hiệu kháng nguyên trên
thì S. Paratyphi B bị ngưng kết và mất khả năng di động. Tuy nhiên, chúng
5


không bị ngưng kết và vẫn di động được khi nuôi trong môi trường có huyết
thanh chỉ kháng một loại đặc hiệu kháng nguyên. Kháng nguyên H dễ bị phá
hủy bởi nhiệt độ, cồn và acid. Kháng nguyên H được ứng dụng để chẩn đoán
huyết thanh [2].
1.1.5.3. Kháng nguyên Vi
Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt. Kháng nguyên Vi là
polysaccaride của N-acetylglucosamine uronic acid dưới dạng một lớp rất
mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học. Kháng nguyên Vi có
thể bao phủ kín kháng nguyên O. Kháng nguyên Vi chịu trách nhiệm sinh độc
tố, có vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh thương hàn. Kháng nguyên này
chỉ có ở S. Typhi và S. Paratyphi C [2].
1.1.6. Phân loại
Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà
chúng gây ra như S. Typhi và các S. Paratyphi A, B, C (typhoid là bệnh thương
hàn và para là phó thương hàn). Salmonella còn được đặt tên theo vật chủ như
S. Typhimurium gây bệnh ở chuột (murine nghĩa là chuột). Về sau người ta
thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân
lập được ở nhiều loài động vật khác nhau. Vì thế, các loài mới phát hiện được
đặt tên theo địa phương nơi nó lần đầu tiên được phát hiện. Ví dụ S. Teheran,
S. Congo, S. London [2].
Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những nghiên cứu sâu về cấu trúc DNA
cho phép xếp tất cả Salmonella vào một loài duy nhất. Tuy nhiên đề xuất này
không được chấp nhận vì cách phân loại truyền thống đã được sử dụng quá
quen và có ý nghĩa thực tiễn riêng [2].
Ngày nay, Salmonella được phân thành hai loài là S. bongori và S.
enterica. Trong đó, S. enterica được chia thành 6 dưới loài là: I (enterica), II
(salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica). Hiện
nay, người ta đã phát hiện được 2.610 serovar khác nhau (hình 1.2). Salmonella
được phân thành các serovar bằng cách sử dụng hệ thống phân loại cổ điển của
Kauffman. Các serovar được xác định nhờ sự kết hợp của 46 kháng nguyên O
6


và 85 kháng nguyên H (bao gồm kháng nguyên H1 và H2). Sự kết hợp này tạo
ra khoảng 1.500 serovar trong S. enterica subspecies enterica và khoảng 1.000
serovar trong các phân loài khác của S. enterica và S. bongori [6].

Hình 1.2. Phân loại Salmonella [6].
Chú thích: Salmonella được phân thành hai loài là S. bongori và S.
enterica. Salmonella còn được chia thành dưới loài, trong đó, S. enterica gồm
6 dưới loài là I, II, IIIa, IIIb, IV và VI. S. bongori thuộc dưới loài V với 23
serovar. Salmonella dưới loài I có số lượng lớn nhất (1.547 serovar) trong đó
99% gây nhiễm trùng ở người và động vật.

7


1.2. Đặc điểm hệ gen của Salmonella
1.2.1. Cấu trúc hệ gen
Kích thước hệ gen của Salmonella rất khác nhau, dao động từ 3,39 Mb
đến 5,59 Mb. Số gen trung bình của Salmonella là 4.742 (dao động từ 3.969
đến 9.898 gen). Không có mối liên quan giữa kích thước hệ gen và số lượng
gen. Ngoài ra, Salmonella còn sở hữu từ 1 đến 2 plasmid. Các plasmid của
Salmonella có kích thước rất khác nhau, dao động từ 2 kb đến 200 kb. Tuy
nhiên, hầu hết Salmonella enterica không có plasmid. Ví dụ, các serovar như S.
Typhi, S. Paratyphi, S. Hadar, S. Infantis và hầu hết các serovar độc khác
thường không có plasmid. Ngược lại, các Salmonella thường xuyên gây bệnh
ở người và động vật, ví dụ, S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Dublin, S.
Choleraesuis, S. Gallinarum, S. Pullorum, và S. Abortus-ovis thường sở hữu
plasmid. S. enterica cần khoảng 3.499 gen và S. bongori cần khoảng 3.368 gen
để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng bình thường [7].
So sánh trình tự protein ở Salmonella enterica người ta thấy rằng chúng
có độ tương đồng từ 65% đến 99%. Hệ gen của Salmonella có tính bảo thủ cao
và sự biến đổi trong hệ gen thường chỉ tập trung vào một số vùng đặc biệt. Có
khoảng 2.800 họ gen có mặt ở tất cả các Salmonella và tổng số họ gen của tất
cả các serovar là khoảng 10.000 (hình 1.3). Salmonella có số lượng lớn các gen
có tính bảo thủ cao, bên cạnh đó, số lượng các gen thu được trong quá trình
sống cũng rất phong phú, bao gồm các Salmonella Pathogenicity Islands (SPI),
các yếu tố di truyền chuyển vị, thực khuẩn thể, và plasmid (hình 1.4). Các gen
thu được này thường biến đổi, phong phú và khác nhau giữa các serovar [8].

8


Hình 1.3. Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8].
Chú thích: hình bông hoa thể hiện gen chung và các gen riêng ở các
serovar khác nhau. Salmonella có khoảng 2.811 gen chung (vòng tròn ở trung
tâm cánh hoa) và các gen riêng tùy thuộc vào các serovar với số lượng rất khác
nhau (phần cánh hoa).

Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen của S. Gallinarum [9].
Chú thích: vòng tròn ngoài cùng thể hiện vị trí các vùng gen khác nhau.
Vòng tròn thứ hai từ ngoài vào thể hiện kích thước của hệ gen. Vòng tròn thứ
9


ba và thứ tư thể hiện vị trí của các vùng gen mã hóa theo chiều kim đồng hồ và
ngược chiều kim đồng hồ. Vòng tròn thứ năm thể hiện vị trí của các gen giả.
Vòng tròn số 6 là gen chung với S. Typhimurium LT2 (màu xanh lá cây). Vòng
tròn số 8 là các gen chung với S. Enteritidis PT4 (màu xanh lam). Vòng tròn số
7 là gen riêng so với S. Typhimurium LT2 (màu hồng). Vòng tròn số 9 là gen
riêng so với S. Enteritidis PT4 (màu xám). Vòng tròn số 10 là vị trí các rRNA
(màu đỏ).
Hệ gen của Salmonella rất giống với hệ gen của E. coli nhưng có thêm
một số lượng lớn các gen độc tố. Một số các gen độc này tập trung thành các
cụm trong hệ gen, còn được gọi là GI (genomic island), GI là một đoạn DNA
kích thước lớn, thu được nhờ hình thức chuyển ngang. Các GI nằm gần các gen
tRNA, người ta cho rằng gen tRNA là nguyên nhân để tích hợp GI vào nhiễm
sắc thể của Salmonella. Các GI và SPI có vai trò tạo ra độc tố và tạo ra khả
năng xâm nhập của vi khuẩn. Nhiều SPI được tìm thấy nằm bên cạnh một gen
mã hóa cho tRNA, tỷ lệ GC của chúng cũng khác so với tỷ lệ GC của hệ gen.
Vì vậy, hầu hết các SPI là gen ngoại lai được chèn vào hệ gen của Salmonella.
Hiện nay người ta đã tìm thấy 23 SPI, tuy nhiên, chức năng của các gen độc
trên các SPI còn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Ngoài SPI-1 và SPI-2 là được
nghiên cứu đầy đủ, vai trò gây bệnh của các SPI khác còn ít được biết đến [10].
Sự khác biệt chính trong hệ gen của Salmonella xảy ra chủ yếu do sự tái
sắp xếp lại hệ gen liên quan đến tái tổ hợp của các operon rRNA khác nhau
hoặc các yếu tố chèn IS200. Mỗi serovar tiến hóa thông qua việc tiếp nhận các
yếu tố di truyền bằng chuyển gen theo chiều ngang hoặc do sự thoái biến các
gen. Sự đa dạng trong hệ gen của Salmonella chủ yếu là do các SPI, plasmid,
và thực khuẩn thể. Trong đó, các thực khuẩn thể tích hợp vào hệ gen là một
trong những yếu tố chính tạo ra sự đa dạng di truyền trong bộ gen của
Salmonella [11].
1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella
10


Vi khuẩn kháng kháng sinh theo nhiều cách khác nhau như làm biến đổi
hoặc phá hủy kháng sinh, bơm kháng sinh ra khỏi tế bào bằng hệ thống bơm
thải thuốc (efflux pumps), biến đổi hoặc thay thế mục tiêu tác dụng của kháng
sinh, và giảm tính thấm của màng tế bào. Có nhiều nhóm kháng sinh khác nhau,
nhưng Salmonella thường đề kháng một số nhóm kháng sinh phổ biến gồm
aminoglycoside,

β-lactam,

chloramphenicol,

quinolone,

tetracycline,

sulfonamide và trimethoprim [12].
1.2.2.1. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside
Có ba cơ chế đề kháng aminoglycoside ở vi khuẩn là: (1) làm giảm hấp
thụ kháng sinh hoặc giảm tính thấm màng tế bào, (2) thay đổi các vị trí liên kết
của kháng sinh trên ribosome và làm biến đổi kháng sinh, (3) ở E. coli, khả
năng đề kháng aminoglycoside là do các kênh bơm thải kháng sinh ra khỏi tế
bào. Cơ chế này không đóng vai trò quan trọng trong đề kháng aminoglycoside
ở Salmonella nhưng tạo điều kiện để đề kháng các kháng sinh khác. Chưa thấy
báo cáo nào về biến đổi ribosome là nguyên nhân gây kháng aminoglycoside ở
Salmonella. Loài vi khuẩn này sử dụng các cơ chế như biểu hiện các enzyme
để biến đổi aminoglycoside qua trung gian plasmid để đề kháng kháng sinh
này. Các enzyme này được phân loại thành ba nhóm và được đặt tên dựa trên
các phản ứng mà chúng thực hiện, gồm acetyltransferase, phosphotransferase
và nucleotidyltransferase [12].
Tùy thuộc vào khu vực mà enzyme làm biến đổi, người ta phân AAC
(aminoglycoside acetyltransferase) thành bốn nhóm enzyme, bao gồm AAC
(1), AAC (2'), AAC (3) và AAC (6'). Các gen mã hóa các enzyme này gọi là
aac. Những gen này đã được tìm thấy ở nhiều serovar như S. Agona, S.
Typhimurium, S. Newport, S. Copenhagen, S. Kentucky. Aminoglycoside
acetyltransferase có khả năng đề kháng tobramycin, gentamicin, và kanamycin.
Aminoglycoside phosphotransferase được chia thành hai nhóm tùy thuộc vào
vị trí đặc hiệu mà chúng tiến hành phosphoryl hóa. Nhóm APH (3”) và APH
(6) có khả năng đề kháng streptomycin. Hầu hết các gen mã hóa enzyme này
được đặt tên là aph. Nucleotidyl transferase có khả năng đề kháng
11


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×