Tải bản đầy đủ

Tìm hiểu về quá trình tách chiết DNA và một số ứng dụng trong thực tiễn si01

CHUYÊN ĐỀ

TÌM HIỂU VỀ TÁCH
CHIẾT DNA VÀ MỘT
SỐ ỨNG DỤNG TRONG
THỰC TIỄN


Tháng 8 năm 2019
MỤC LỤC


A. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành kinh tế - xã hội, khoa học
công nghệ đã và đang đạt được những thành tựu đáng kể. Trong đó, các hướng
nghiên cứu khoa học về DNA và nhiễm sắc thể luôn được các nhà khoa học đặc biệt
quan tâm.
DNA có vai trò thiết yếu trong hệ thống sống, quy định đặc tính di truyền,
lưu trữ và truyền đạt thông tin, điều hòa hoạt động gene,...Việc tìm ra biên pháp
tách DNA ra khỏi tế bào sinh vật có ý nghĩa vô cùng to lớn, góp phần nghiên cứu

sâu hơn về cấu trúc DNA, đặc điểm thông tin di truyền của các loài, hướng tới sản
xuất các chế phẩm sinh học hay phương pháp điều trị bệnh mới dựa trên nguyên lý
hoạt động gene cũng như ứng dụng vào thực tiễn đời sống.
Trong chương trình sinh học phổ thông, các kiến thức về DNA khá trừu
tượng, chủ yếu cung cấp khái quát về cấu trúc, chưa đi sâu vào ứng dụng. Nhằm
giúp các em học sinh nâng cao hiểu biết và có thêm hứng thú về sinh học phân tử
cũng như tách chiết DNA kèm theo ứng dụng của chúng trong thực tiễn, chuyên đề
“ Tìm hiểu về quá trình tách chiết DNA và một số ứng dụng trong thực tiễn”
được thực hiện.
2. Mục đích của đề tài
Tổng hợp một số kiến thức chung về DNA, qua đó nêu bật lên đặc điểm,
chức năng và cơ chế hoạt động của DNA.
Quy trình, phương pháp tách chiết DNA kèm theo các ưu, nhược điểm của
từng phương pháp. Chỉ ra một số ứng dụng thực tiễn.
Giới thiệu một số câu hỏi, bài tập vận dụng chuyên sâu.


B. NỘI DUNG
I. KIẾN THỨC CƠ BẢN VỀ NUCLEIC ACID
1.1. Nucleic acid.

Nucleic acid – vật chất mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là
một polymer được hình thành từ các monomer là nucleotide.
Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (5C) và
một base hữu cơ (vì các nucleotide chỉ khác nhau ở base nên người ta thường dùng
từ base thay cho nucleotide). Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: các purin gồm
adenine và guanine, các pyrimidine gồm thymine, cytosine và uracil. Các nucleotide
đucợ nối với nhau bằng các liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài.
Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau là
desoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA).
1.2. DNA (Desoxyribonucleic acid)

1.2.1. Khái niệm và đặc điểm của DNA
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đối song song, mỗi mạch
là một chuỗi nucleotide. Mỗi nucleotide gồm một nhóm phosphate, 1 gốc đường
desoxyribose và một trong bốn base (adenine, cytosine, guanine và thymine). Hai
mạch đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hyđro hình thành giữa các base bổ sung
nằm trên hai mạch: A liên lết bổ sung với T bằng hai liên kết hyđro, G liên kết bổ
sung với C bằng ba liên kết hyđro. Mạch dù, các liên kết hyđro là các liên kết yếu
nhưng phân tử DNA gồm rất nhiều đơn phân nên số lượng liên kết hydro là cực kỳ


lớn làm cho DNA vừa có tính bền vững, vừa có tính linh hoạt.
Một đặc điểm của DNA là tính đối song. Mỗi mạch đơn là một trình tự có định
hướng với một đầu mang nhóm phosphate (P) tự do gắn vào C 5 của đường
desoxyribose nên gọi là đầu 5’P, đầu kia mang nhóm hydroxyl (OH) tự do ở vị trí
C3 nên gọi là đầu 3’OH, hướng quy ước là 5’  3’ và đầu 5’P của mạch này đối diện
với đầu 3’OH của mạch bổ sung.


Hai chuỗi polynucleotide của phân tử DNA không chỉ liên kết với nhau bằng
liên kết hydro mà chúng còn xoắn lại quang một trục tưởng tượng tạo nên chuỗi
xoắn kép đều đặn như một cầu thang xoắn. Trong đó, các bậc thang là các base nito,
còn thành và tay vịnh là các phân tử đường và các nhóm phosphate.
Hai mạch của phân tử DNA gắn với nhau nhờ liên kết hydro, nếu có các tác
động nào đó làm đứt các liên kết này thì hai mạch sẽ tách rời nhau. Khi đun nóng
phân tử DNA vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80 – 90 0C), các liên kết hydro giữa
hai mạch bị đứt và chúng tách rời nhau, được gọi là hiện tượng biến tính DNA.
Nhiệt độ làm hai mạch DNA tách rời gọi là điểm chảy.
Nhiệt độ này đặc trưng cho mỗi loại DNA, phụ thuộc vào số lượng các liên kết
hydro. DNA có tỷ lệ G – C cao sẽ có điểm chảy cao hơn. DNA có 60% G – C thì có
điểm chảy khoảng 950C. Đoạn DNA càng dài sẽ dẫn đến số lượng liên kết hydro
tăng do đó điểm chảy cũng tăng.
Sự biến tính của DNA có thể thuận nghịch, nếu DNA đã bị biến tính được hạ
nhiệt độ từ từ trở lại bình thường chúng có thể gắn lại với nhau tạo thành mạch kép,
đó được gọi là hiện tượng hồi tính DNA. Đây là một đặc điểm quan trọng làm cơ sở
cho kỹ thuật lai acid nucleic và tách chiết DNA.
1.2.2. DNA của Prokaryotae
Bộ gene của đa số Prokaryotae là một phân tử DNA có dạng vòng tròn và
không gắn với protein.
DNA có thể ở 3 dạng cấu trúc (topological structure):
+ Dạng thứ nhất: siêu xoắn, khi mạch kép vặng xoắn hình số 8. Đây là dạng
tự nhiên trong tế bào vi khuẩn.
+ Dạng thứ hai: vòng tròn, khi sợi DNA căng tròn. Dạng này có được do
DNA siêu xoắn bị cắt đứt 1 trong 2 mạch kép.
+ Dạng thứ ba: thẳng, khi DNA bị đứt cả hai mạch.
Thường trong tế bào prokaryotae, DNA ở dạng siêu xoắn.
1.2.3. DNA của Eukaryotae
Phần lớn DNA trong tế bào Eukaryotae có dạng thẳng mạch xoắn kép và gắn
với nhiều loại protein. Trong số đó, protein histone giữ vai trò cốt lõi trong việc


cuộn lại và điều hòa hoạt tính của DNA. Các histone là những protein nhỏ chứa
nhiều amino acid mang điện tích dương nên gắn chắc với DNA mang điện tích âm.
DNA Eukaryotae có kích thước rất lớn nên tế bào cần giải quyết được vấn đề
nén chặt phân tử này vào thể tích rất hạn chế của nhân. Việc nén được thực hiện qua
nhiều mức độ, thấp chất là nucleosome và cao nhất là cấu trúc chất nhiễm sắc. Sự
hình thành nhiễm sắc thể kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép DNA qua hệ thống các bậc cấu
trúc sau:
+ Nucleosome là đơn vị cấu trúc của nhiễm sắc thể được tạo nên do sợi DNA
dài quấn quanh các protein histone, hình thành sơi 11nm. Đơn vị này là phức hợp
gồm 146 cặp base của DNA quấn quanh 8 phân tử histone (2 H2A, 2 H2B, 2 H3 và
2 H4). Các nucleosome kề nhau được nối qua một phân tử histone trung gian (H1).
+ Sợi chromatin dày 30nm gồm các nucleosome xếp khít nhau tạo thành phức
hợp nucleoprotein.
+ Vùng xếp cuộn dày 300nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúc
tạo nên.
+ Chất dị nhiễm sắc 700nm.
Cuối cùng khi chất nhiễm sắc đạt độ nén chặt cực đại, nó trở thành nhiễm sắc
thể (1400nm). Đó là khi tế bào phân chia.
1.2.4. Chức năng của DNA
Mỗi một tế bào trên hành tinh chúng ta đều lưu trữ thông tin di truyền trong
cùng một dạng hóa chất, đó là DNA mạch kép. Tuy cấu trúc của DNA đơn giản hơn
nhiều so với protein nhưng nó thỏa mãn đầy đủ các chức năng cả vật chất di truyền.
DNA có khả năng mang thông tin di truyền. Phân tử DNA có chiều ngang
giới hạn nhưng chiều dài không hạn chế, trình tự các nucleotide sắp xếp theo chiều
dài có thể phản ánh những thông tin nhất định. Tuy DNA chỉ gồm 4 loại nucleotide
(A, T, G, C) nhưng số loại tổ hợp trình tự khác nhau là một con số khổng lồ. Khả
năng chứa thông tin đó làm cho DNA là phân tử dài nhất trong tự nhiên, chứa cả
chương trình phát triển của mỗi tế bào. Đặc biệt 64 bộ ba mã hóa cho tổng hợp
protein cũng giống nhau ở tất cả các tế bào của tất cả sinh vật từ vi khuẩn đến con
người. Ngoài việc chứa thông tin theo chiều dài, khả năng này còn được mở rộng do
các thay đổi cấu trúc: gãy nối lại tạo các xen đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn,...


DNA có khả năng tự sao chép chính xác làm cơ sở cho quá trình sinh sản nối
tiếp các thế hệ, đảm bảo duy trì bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của loài. Chuỗi xoắn
kép gồm hai mạch bắt bổ sung A –T, G – C, làm cho phân tử có khả năng bắt cặp
chính xác và sửa sai ngay trên chính phân tử đó. Mỗi mạch có thể làm khuôn để
tổng hợp lại mạch còn lại tạo ra phân tử DNA giống hệt ban đầu.
DNA còn có khả năng tự sửa sai nhờ đó thông tin di truyền có tính ổn định
rất cao. Có thể nói DNA là hợp chất kỳ diệu nhất trong thiên nhiên.
1.3. RNA (Ribonucleic acid)
1.3.1. Khái niệm và đặc điểm của RNA
Các RNA giữ vai trò trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp protein. Tất
cả chúng đều được tổng hợp từ các gen tương ứng trên DNA. Phân tử RNA có cấu
trúc tương tự DNA với ba điểm khác biệt sau:
+ Phân tử RNA là chuỗi đơn.
+ Pentose của phân tử RNA là ribose thay vì deoxyribose.
+ Thymine, một trong bốn loại base hình thành nên phân tử DNA, được thay
thế bằng uracil trong phân tử RNA.
1.3.2. Các loại RNA
1.3.2.1. RNA ribosome
rRNA là thành phần cấu tạo, chiếm phân nửa khối lượng ribosome nên rRNA
chiếm tỷ lệ cao, có thể đến 75% của tổng RNA. Các loại phân tử RNA khác nhau
được đánh giá và đặt tên theo hệ số lắng khi siêu li tâm là S. S càng lớn RNA càng
dài.
Các ribosome của lục lạp, ty thể và vi khuẩn có hệ số lắng là 70S gồm hai
tiểu đơn vị:
+ Tiểu đơn vị lớn 50S có 1 rRNA 23S và 1rRNA 5S.
+ Tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ có 1 rRNA 16S.
Các ribosome của sinh vật nhân thcuwj thuộc loại 80S, gồm hai tiểu đơn vị:
+ Tiểu đơn vị lớn 60S có 1 rRNA 28S, 1 rRNA 5,8S và 1 rRNA 5S.
+ Tiểu đơn vị nhỏ 40S chỉ có 1 rRNA 18S.
1.3.2.2. Các tRNA vận chuyển (transfer RNA)


Trong quá trình dịch mã, trước khi tạo thành chuỗi polypeptide, các amino
acid phải được gắn với một chất trung gian, chất này phải đặc hiệu với các báe trên
mRNA. Chất trung gian này được gọi làd tRNA. Mỗi phân tử tRNA gắn với một
amino acid và mang đến ribosome.
tRNA có một số đặc tính chung: chiều dài khoảng từ 73 đến 93 nucleotide,cấu
trúc gồm một mạch cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử và
đầu mút 3’ có trình tự kết thúc CCA. Amino acid luôn gắn vào đầu CCA.
Mỗi amino acid có một codon là trình tự 3 nucleotide trên mRNA. Mỗi tRNA
có ở vị trí nhô ra một bộ ba không bắt cặp của các base gọi là anticodon, mà bộ ba
này bổ sung với trình tự codon trên mRNA tưng ứng với một amino acid đặc hiệu.
1.3.2.2. Các mRNA thông tin
ARN thông tin được phiên mã từ các gen trong DNA, có cấu trúc chuỗi đơn,
độ dài thay đổi tùy theo độ dài của gen tương ứng mà chúng đucợ phiên mã.
mRNA thường chứa trình tự nucleotide nhiều hơn số dùng mã hóa cho protein.
Đầu 5’ có mang các tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã. Đuôi 3’
sau tín hiệu kết thúc có đoạn 3’ không mã hóa là nơi gắn đuôi poly–A, độ dài của
đoạn poly-A phản ánh tuổi thọ của chuỗi mRNA.


II. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID –PHƯƠNG
PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CƠ BẢN
1.1. Vai trò của việc tách chiết nucleic acid
Tất cả các nghiên cứu và ứng dụng về sinh học phân tử chỉ được tiến hành khi
có được một lượng acid nucleic đủ lớn, đủ tinh sạch.
Tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu về sinh học phân tử, phân loại và
đa dạng di truyền.
1.2. Phương pháp tách chiết DNA
1.2.1. Yêu cầu
− Thu nhận lượng DNA đủ lớn và tinh sạch.
− Các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ
học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các
enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ.
− Tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội
bào.
− Phân tử DNA có kích thước lớn do đó trong thao tác cần tránh mọi tác nhân cơ học
hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này.
1.2.2. Phương pháp tách chiết DNA
 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào eukaryote).
Mục đích: Phá màng TB và màng nhân.
Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học tùy từng loại tế bào.
Phương pháp:
+ Nghiền TB trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarkosyl) và proteinase
(proteinase K).
+ Phá vỡ màng TB và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời
phân hủy các protein liên kết với DNA.
SDS (sodium dodecyl sulfate): Chất tẩy rửa, làm gãy các liên kết không cộng
hóa trị.
Sarkosyl: Hòa tan các protein màng.


Proteinase K: Enzyme phân cắt protein (protease).
Đối với vi khuẩn: thường dùng lysozyme và EDTA để phân giải màng.
EDTA (Ethylendiamin Tetraacetic Acid): Các acid nội bào thủy phân nucleic acid
cần có các ion hóa trị như Mg2+, Ca2+ để hoạt động. EDTA liên kết với các ion hóa
trị trên  ức chế hoạt động của nucleic acid.
Đối với thực vật: do có vỏ cellulose, nên phải được nghiền trong nitơ lỏng ở
196oC, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, đồng thời bảo vệ
DNA phóng thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào.
 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein.
Mục đích: Loại bỏ các thành phần không phải là DNA.
Dùng dung dịch phenol:chloroform làm biến tính protein.
Phenol-Chloroform không tan trong nước và làm biến tính protein. Protein sẽ
bị tủa khi gặp phenol. DNA thì không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước.
Sau li tâm, thu được phần nước phía trên ống nghiệm chứa DNA hòa tan,
phần giữa là protein kết tủa, phần dưới đáy ống nghiệm là các tạp chất lẫn khác.
 Bước 3: Tủa nucleic acid
Mục đích:
+ Thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc.
+ Bảo quản tránh tác dụng của các enzyme phân huỷ nucleic acid.
+ Hòa tan nucleic acid lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.
− Tủa trong ethanol (ethylic alcohol)
Điều kiện:
+ Môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao).
+ Vethanol : V mẫu = 2,5 : 1 Lượng dư ethanol làm kết tủa hoàn toàn DNA.
+ Nhiệt độ thấp. Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tạo kết tủa.
− Tủa trong isopropanol
Điều kiện:
+ Không cần sự hiện diện của muối.
+ Visopropanol : Vmẫu = 1:1.


Ưu điểm: Các DNA có trọng lượng phân tử thấp (những mảnh gãy DNA
hoặc ARN,…) không bị kết tủa và chúng dễ dàng bị loại bỏ cùng dung dịch.
Nhược điểm: Một số muối khó hòa tan trong isopropanol, do đó các muối
này thường kết tủa cùng DNA  cần rửa thêm nhiều lần để loại bỏ hết các muối còn
lẫn tạp.
Sau khi tạo tủa từ 2 phương pháp trên, đem dung dịch li tâm thu được DNA
cô đặc (pellet).
Lưu ý: Cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc
các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu.
1.3. Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA

1.3.1. Yêu cầu
Các phân tử RNA không bên và dễ bị phân hủy bởi các enzyme là
ribonuclease. Các enzyme này lại có mặt ở khắp nơi, ngay cả trên đầu ngón tay của
người thao tác, có hoạt tính rất cao và bên vững với các tác nhân thường dùng để
loại bỏ enzyme.
Do đó:
+ Tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm
bởi các RNase từ môi trường.
+ Thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử
trùng bằng nhiệt hay hóa chất.
+ Tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần.
1.3.2. Phương pháp tách chiết RNA
 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân
Tế bào, mô được nghiền trong dung dịch gồm:
+ Chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao
+ Tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thiocyanate)
+ Chất khử (2-mercaptoethanol)
Hai chất sau có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các
protein liên kết khỏi các phân tử RNA


 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein.
Các protein được loại ra khỏi mẫu qua xử lí phenol chloroform và li tâm
 Bước 3: Tủa nucleic acid
RNA hòa tan trong nước được tủa bằng ethanol và được thu nhận lại qua li
tâm.
RNA được bảo quản trong dung dịch ethanol dưới dạng tủa hoặc đông lạnh ở
-700C trong nước có chứa Rnasine (một chất ức chế RNase).
1.3.3. Phân lập các loại RNA sau tách chiết
rRNA và tRNA có kích thước và trình tự xác định nên có thể tách riêng dễ
dàng bằng phương pháp li tâm, điện di,..
mRNA có kích thước và trình tự vô cùng đa dạng. Tuy nhiên chúng có điểm
chung là cấu trúc đuôi poly-A. Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung AT của nucleic acid, người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái lực trên
cột oligodT-cellulose. Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qua
liên kết bổ sung với oligodT, các viên bi này sẽ được thu nhận lại qua li tâm và
mRNA sẽ được tách khỏi các viên bi và được giữa lại.
Sau quá trình tách chiết, các nucleic acid được tinh sạch bằng siêu li tâm, sắc
ký hay điện di.
1.4. Siêu li tâm

 Siêu li tâm trên đệm CsCl liên tục:
Siêu li tâm trên một gradient liên tục CsCl. Dung dịch CsCl đậm đặc trong ống
li tâm sẽ tự động hình thành một gradient tỉ trọng tăng dần từ miệng ống xuống đáy.
Các nucleotide di chuyển trong ống dưới tác động của lực li tâm, đến vị trí có
tỉ trọng bằng tỉ trọng của lớp cố định trong ống. Lớp này sẽ được thu nhận lại sau li
tâm.
Kỹ thuật này được ứng dụng để tinh sách plasmid và phage.
 Siêu li tâm trên đệm CsCl không liên tục:


Hỗn hợp nhiều nucleic acid có tỉ trọng biết trước khác nhau được đặt trên lớp
CsCl đệm.
Trong quá trình li tâm chỉ những phân tử có tỉ trọng cao hơn tỉ trọng lớp đệm
mới di chuyển xuyên qua được lớp đệm. Thông thường, ống li tâm gồm nhiều lớp
đệm có tỉ trọng tăng dần từ miệng đến đáy ống nghiệm.
Nucleic acid cần tinh sạch sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp đệm.
Kỹ thuật này được sử dụng để tinh sạch một lượng lớn phage.
 Siêu li tâm trên gradient saccharose
Dùng để phân tách thô một hỗn hợp có kích thước chênh lêch nhau nhiều kb.
Ứng dụng trong chọn lọc các đoạn DNA có kích thước xác định dùng trong
việc thiết lập các ngân hàng gen.
1.5. Phương pháp sắc kí

Sắc kí ái lực: dùng để tinh sạch mRNA.
Sắc kí lọc gel: dùng để phân tách các nucleic acid và các nucleotide tự do sau
quá trình tạo mẫu dò đánh dấu.
Sắc kí trao đổi ion trên vi cột: để thu hồi những lượng rất nhỏ DNA.
Sắc kí lỏng hiệu suất cao: dùng tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp,
plasmid, phân tách các đoạn DNA.
1.6. Các phương pháp phân tích định tính và định lượng thô nucleic acid

1.6.1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế
Phương pháp cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong
mẫu.
Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm
của các base purin và pyrimidine.
Các bước trong phương pháp định lượng bằng quang phổ kế:
-

Đo giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu đo.
Xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là:
+ 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi (do mật độ base dày hơn so với
cấu trúc sợi đơn).
+ 40 µg/ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn.


VD: Giá trị OD260nm = 0,9 tương ứng.
+ dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi = 0,9 x 50 = 4,5 µg/ml.
+ dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA = 0,9 x 40 = 3,6
µg/ml.
Điều kiện: Chỉ dùng với dung dịch nucleic acid sạch.
Lưu ý: Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở
280nm (OD280nm) do bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Ngoài ra,
các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid do đó
làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được
xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số: OD 260nm/OD280nm nằm trong khoảng
1.8 – 2.
1.6.2. Phương pháp điện di
Sử dụng trong phân tích định tính
Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của nucleic acid. Nucleic acid tích
điện âm (do có H3PO4) nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di
chuyển về cực dương của điện trường.
Khả năng di chuyển (tính linh động) của phân tử phụ thuộc vào:
+ Khối lượng phân tử (số lượng nucleotide hay cặp nucleotide)
+ Nồng độ chất tạo gel (Kích thước đoạn cần phân tách càng lớn, nồng độ
gel càng nhỏ).
Việc chọn loại gel và nồng độ tùy thuộc kích thước trung bình của các
đoạn nucleic acid cần phân tách.
 Bằng gel agarose
Thông dụng nhất, thường dùng phân tách những đoạn có kích thước khoảng
0,5 – 20 kb.
Gel được đổ trên giá thể nằm ngang, điện di thực hiện theo phương nằm
ngang.
Các nucleic acid trong gel sẽ hiện hình dưới tia UV nhờ ethidium bromide.
Chất này gắn xen vào giữa các base của nucleic acid, dưới tác dụng của tia UV sẽ
phát huỳnh quang. Sau điện di, gel được hiếu sáng bằng tia UV (ʎ ≈ 300nm),
nucleic acid sẽ hiện hình dưới dạng vạch đỏ cam.


Để ước lượng kích thước các tình tự nucleic acid trong gel agarose, người ta
sử dụng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử”:là tập hợp nhiều trình tự DNA có
kích thước đã biết (thang DNA).
Người ta thường sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể lamda được thuỷ giải
bởi enzyme giới hạn HindIII.
Quy trình chuẩn bị gel agarose:
+ Đổ dung dịch agarose đã đun tan, để nguội vào giá có lắp lược.
+ Rút lược ra sau khi gel đã đặc.
+ Đặt gel vào buồng điện di chứa dung dịch điện di.
+ Buồng điện di được nối với nguồn điện.
 Bằng gel polyacrylamide
Dùng tách các đoạn có kích thước nhỏ (dưới 1000 cặp base). Thao tác phức
tạp hơn agarose.
Các ứng dụng chủ yếu:
+ Tinh sạch oligonucleotide tổng hợp.
+ Xác định trình tự DNA.
+ Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base.
Gel được đổ giữa 2 tấm thủy tinh, phương của điện di là phương thẳng đứng.
 Điện di trong trường xung
Thực hiện khi:
+ Tách phân tử DNA rất lớn (>50kb).
+ Không phân tách được bằng gel agarose dù ở nồng độ tối thiểu là 0,4%.
Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di.
Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải định hướng lại.Thời gian
cần cho việc tự định hướng tùy thuộc kích thước phân tử (phân tử càng dài  thời
gian định hướng lại càng lớn  di chuyển chậm.
 Cách thu nhận mẫu sau khi điện di
Phần agarose chứa các vạch được cắt ra và DNA được thu nhận sau khi đã
khuếch tán từ gel agarose vào 1 dung dịch đệm thích hợp.
Một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trước vạch DNA. “Giếng”
này được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được tái lập. DNA di chuyển vào
“giếng” chứa đầy dung dịch đệm và được thu nhận lại.


Điện di được thực hiện trong 1 gel agarose đặc biệt (Nusieve hay Seaplaque)
có điểm nóng chảy rất thấp (65oC).Sau điện di, vạch DNA được cắt ra, ủ trong 1
dung dịch đệm ở nhiệt độ 65oC. Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy, DNA được thu
nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa.


III. MỘT SỐ VI DỤ TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID VÀ ỨNG DỤNG
1.1. Tách DNA từ lá tươi và lá khô của cây Terminalia arjuna
T. Arjuna có chứa hàm lượng cao các polysaccharide dính và polyphenolcó
tác dụng như 1 chất ức chế trong quá trình phân lập DNA. Những chất ức chế này
kết tủa cùng với DNA, do đó làm giảm chất lượng và hiệu suất DNA Vì vậy, DNA
được phân tách từ các phương pháp cũ bị nhiễm vàng, dính và nhớt  Cần thêm các
bước để loại hai chất này.
Bước 1: Phá màng TB và màng nhân bằng cách nghiền trong nitơ lỏng.
Bước 2: Chuyển phần lá đã nghiền vào ống li tâm và thêm vào dung dịch
đệm rửa (có tác dụng loại polyphenol). Lắc mẫu, quay li tâm, thu phần kết tủa
phía dưới.
+ Phần nổi phía trên là polyphenols cần loại bỏ.
- Thêm dung dịch đệm tách chiết vào, quay li tâm. Loại bỏ phần nổi.
+ Dung dịch đệm tách chiết làm biến tính protein (cắt cầu nối disulfite)
 protein nổi lên phía trên  loại bỏ.
+ Dung dịch đệm tách chiết bảo vệ DNA không bị biến tính.
- Thêm dung dịch đệm hòa tan, SDS vào kết tủa.
+ Dung dịch đệm hòa tan giúp các DNA không bị cắt bởi các enzyme
được giải phóng từ TB.
- Thêm dung dịch Ammonium acetate 7.5 M. Quay li tâm.
+ Ammonium acetate loại bỏ oligonuleotitde ngắnvà những nucleotide
tự do khác (dNTPs) Thu DNA tổng.
+ Tạo tủa protein, giúp loại bỏ protein bám xung quanh DNA.
- Chuyển lớp dịch trong phía trên (chứa nucleic acid) sang ống mới.
Bước 3: Bổ sung isopropanol lạnh, quay li tâm. Loại dung dịch phía trên, thu
acid nucleic kết tủa.
+ Làm kết tủa acid nucleic ở hàm lượng cao.


+ Ở điều kiện này nhiều protein và các chất khác cũng bị kết tủa cùng
DNA nên trong mẫu sẽ bị lẫn tạp.
-Rửa phần acid nucleic kết tủa 2 lần với ethanol 70% loại bỏ muối, làm sạch
phần tủa.
- Sấy khô nucleic acid cô đặc và làm tan trong dung dịch đệm bảo quản.
+ Dung dịch đệm bảo quản bất hoạt enzyme nuclease, bảo vệ DNA
trong mẫu.
-Thêm RNaseA và ủ ở 37oC.
+ RNase cắt RNA thành những mảnh vụn.
+ RNase có nhiệt độ tối ưu 37oC.
- Tách chiết với chloroform:isoamyl (24:1). Quay ly tâm. Chuyển lớp dịch
phía trên (có chứa DNA) vào ống sạch.
+ Cloroform:isoamyl làm tủa RNA, protein, polysaccharide và phức
hợp (Chloroform làm biến tính protein, Isoamylalcohol làm giảm bọt, ổn định dung
dịch sau ly tâm).
+ Sau khi li tâm, dung dịch chia ra thành 3 lớp: lớp thứ nhất là phần
dịch trong ở trên cùng có chứa DNA, lớp thứ hai là một lớp protein, lớp kế tiếp có
chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides,
protein,…).
-Thêm 2 lần thể tích dịch ethanol lạnh vào ống chứa DNA. Quay ly tâm. Thu
DNA cô đặc.
+ Ethanol lạnh giúp tủa acid nucleic ở nồng độ cao. Lượng dư ethanol
làm kết tủa hoàn toàn DNA.
- Rửa DNA cô đặc với 70% ethanol.
- Làm khô DNA (cô đặc) trong chân không và hòa tan trong dung dịch đệm
bảo quản hoặc nước cất 2 lần, bảo quản ở -20 oC cho đến khi sử dụngDNA không
bị biến tính.


1.2. Ứng dụng của tách chiết DNA
Mọi nghiên cứu về sinh học phân tử chỉ được tiến hành khi có một lượng DNA
tinh sạch đáp ứng cho nhu cầu của các thí nghiệm, do đó tách chiếc DNA là một kỹ
thuật vô cùng hữu ích cho các kỹ thuật di truyền.
1.2.1. Chuẩn đoán các bệnh, rối loạn di truyền
Trước kia, việc chuẩn đoán rối loạn di truyền thường dựa trên các chỉ tiêu lâm
sàn và thử nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên, các chi tiêu này đa phần kém chính xác và
tốn chi phí cao, đặc biệt không thể dùng để xác định cho người lành mang gen bệnh
hay cho thai nhi. Sinh học phân tử với tính đặc hiệu cao có thể giải quyết vấn đề
này.
Việc phân tích tiến hành trên nguồn DNA thu được từ tế bào của đối tượng,
mà lượng DNA này có thể lấy từ bất cứ các tế bào nào có nhân. Thông qua các kĩ
thuật PCR . trường hợp gen bệnh và tạo dòng, nó sẽ được sử dụng làm mẫu dò để
phát hiện trực tiếp gen bệnh trên bộ gen trong phương pháp Southerm blot.
Trường hợp đối tượng là thai nhi, có thể được thực hiện trước sinh, khi trẻ có
nguy cơ bị mắc bệnh. DNA được tách chiết từ ngoại phôi bì dinh dưỡng
(trophoblast) được đem phân tích và cho kết quả về tình trạng bệnh của thai nhi.
1.2.2. Sản xuất các chất phòng và chữa bệnh
Việc tách chiếc DNA kèm theo các kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp, biến nạp, tải
nạp là cơ sở cho việc sản xuất vacxin và các chất kháng sinh. Với các kỹ thuật sinh
học phân tử, người ta có thể tạo dòng toàn bộ các gen có tham gia vào quá trình sản
xuất kháng sinh; từ đó xác định được số lượng các bước của quá trình sinh tổng hợp
và sản phẩm của từng bước.
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA có khả năng giúp tăng năng xuất tổng hợp kháng sinh
và góp phân điều chế các loại kháng sinh mới.


1.2.3. Liệu pháp gen
Liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào cơ thể thay thế
cho gen bệnh, hoặc đưa 1 gen cần thiết vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được mục
tiêu của liệu pháp.
Tạo vectơ tái tổ hợp mang gen cần chuyển  Đưa vectơ virus mang gen lành
vào tế bào nuôi cấy  Ghép tế bào chứa gen chuyển vào cơ thể.
1.2.4. Pháp y
DNA là vật chất rất bền vững, có khả năng tồn tại nhiều năm ở dạng khô,
ngoài cơ thể và cả rất lâu sau khi chết, điều này kết hợp với kỹ thuật PCR cho phép
phân tích những lượng vật chất cực nhỏ (DNA lấy từ tóc, máu khô,..) và kể cả khi
đã bị phân hủy một phần. Nhờ đó so sánh với DNA đối tượng tình nghi, góp phần
phá án.
1.2.5. Xác định chủng loại, tính đa dạng di truyền
Các mẫu cần xác định tính đa dạng di truyền được tiến hành tách chiếc DNA
sau đó phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD – PCR. Việc phân tích các
chỉ thi DNA cho phép đánh giá một cách chính xác mức độ đa dạng di truyền của
loài, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng ở các cá thể, quần thể.
Ngoài ra việc phân tích DNA còn giúp xác định chính xác chủng, loại ở
những loài sinh vân có các đặc điểm hình thái, sinh lí giống nhau.
1.2.6. Chọn giống cây trồng vật nuôi
Trong phương phpas chọn giống cổ điển, các chỉ tiêu chọn lọc thuộc về kiểu
hình, hình thái và sinh hóa. Các chỉ tiêu này thương không ổn định và chịu ảnh
hưởng mạnh bởi yếu tố môi trường.
Việc sử dụng các thành phần của kiểu gen, các DNA mảker để chọn giống cho
phép bỏ qua các biến động không di truyền, đồng thời theo dõi được các biến động
di truyền không biểu hiện ra kiểu hình nhờ đó chọn lóc được những giống có đặc
tính và ưu điểm nổi bậc.


C. CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP VẬN DỤNG
Câu 1: Hãy giải thích tại sao DNA ở các sinh vật có nhân thường bền
vững hơn nhiều so với các loại RNA?
TL: DNA của sinh vật có nhân thường bền vững hơn RNA vì:
+ DNA được cấu tạo từ hai mạch xoắn đều quanh một trục, còn RNA chỉ
được cấu tạo từ 1 mạch.
+ Hai mạch xoắn kép của DNA có các liên kết Hydro bổ sung cho nhau.
+ DNA thường liên kết với protein nên được bảo vệ tốt hơn.
+ DNA phân bố trong nhân nên không có enzyme phân hủy chúng, trong khi
RNA thường tồn tại ngoài nhân, nơi có nhiều enzyme phân hủy nucleic acid.
Câu 2: Nhiệt độ mà ở đó phân tử DNA sợi kép bị tách ra thành hai mạch
đơn gợi là nhiệt độ nóng chảy (điểm chảy). Hãy cho biết DNA có cấu trúc như
thế nào thì điểm chảy cao và ngược lại?
TL:
+ Những phân tử DNA càng dài thì nhiệt độ nóng chảy càng cao.
+ Phân tử DNA có càng nhiều nucleotide loại G và loại C thì điểm chảy càng
cao. Ngược lại, đoạn DNA có nhiều nucleotide loại A và Loại C thì nhiệt độ nóng
chảy thấp hơn.
Câu 3: Vì sao DNA trong nhân có kích thước rất lớn nhưng vẫn có thể
xếp gọn trong nhân có kích thước vô cùng hạn chế?
TL:


+ Các phân tử DNA được nén chặt trong thể tích rất hạn chế của nhân, việc
nén chặt được thể hiện ở nhiều mức dộ. Thấp nhất là nucleosome, chromatin, vùng
xếp cuộn và nhiễm sắc thể.
+ Ngoài ra còn có các protein liên kết với DNA có vài trò nén chặt DNA nhờ
các liên kết ion giữa các nhánh bên mang điện tích âm với của histone với các nhóm
phosphate mang điện tích dương của DNA.
+ Việc xếp gọn DNA vào trong nhân không gây hạn chế khả năng tiếp xúc
của DNA với protein vì DNA quấn quanh lõi cấu tạo từ nhiều histone nên dù được
nén lại, phần lớn bề mặt của DNA vẫn có thể tiếp xúc được với các protein khác.
Câu 4: Nêu một số đặc điểm cấu tạo của DNA cho thấy DNA ưu việt hơn RNA
trong vai trò là vật chất mang thông tin di truyền.
TL:
+ RNA có thành phần đường là ribose khác với thành phần đường của DNA là
deoxyribose. Đường deoxyribose không có gốc –OH ở vị trí C2. Đay là gốc hóa học
phản ứng mạnh mẽ và có tính ưa nước  RNA kém bền hơn DNA trong môi trường
nước.
+ Thành phần base nito của RNA là Uracil đucợ thay thế bằng thymine ở DNA. Về
cấu trúc hóa học T khác U vì được bổ sung thêm gốc methyl. Đây là gốc kỵ nước,
kết hợp với cấu trúc dạng sợi kép giúp DNA bền hơn RNA.
+ DNA thường có cấu trúc dạng sợi kép giúp các cơ chế sửa chữa DNA diễn ra dễ
dàng hơn, vật chất di truyền bền vững ít bị điến đổi hơn RNA.
+ Base nito U chỉ cần 1 biến đổi hóa học duy nhất để biến đổi thành C, trong khi đó
T cần đến hai biến đổi hóa học mới có thể biến đổi thành C  DNA khó bị biến đổi
đột biến hơn RNA.
 DNA có khả năng mang thông tin di truyền tốt hơn sơ với RNA.


Câu 5: Vì sao qua quá trình phát triển, hệ gen của vi sinh vật nhân sơ
không có dấu hiệu bị lão hóa, trong khi đó hện gen của sinh vật nhân thực lại
có xu hướng ngắn đi?
TL:
+ Hệ gen của vi sinh vật nhân sơ là plasmid có dạng vòng nên trong quá trình
sao chép không bị ngắn đi do đó không bị lão hóa sau nhiều lần nhân đôi, sinh sản.
+Trong khi đó, hệ gen của sinh vật nhân thực lại ở dạng thắng, nên sau mỗi
lần nhân đôi đều có xu hướng ngắn đi, do đó, sau một khoảng thời gian sinh trưởng
và phát triển, sinh vật nhân thực có xu hướng bị lão hóa.
Câu 6: Vì sao trong quá trình tách chiết DNA phải đảm bảo các thiết bị,
hóa chất đều phải vô trùng và tuyệt đối không được đụng tay trần vào thiết bị?
TL:
Trong quá trình tách chiết DNA đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng
do kích thước phân tử DNA rất nhỏ, không thể quan sát được bằng mắt thường. Bên
cạnh đó, khi các thiết bị tách chiết bị nhiễm trùng sẽ dẫn đến sản phẩm acid nucleic
tách chiếc được bị lẫ cả acid nucleic của vi sinh vật bị nhiễm làm cho sản phẩm
không thể tinh sạch loại bỏ acid nucleic của vi sinh vật ra khỏi sản phẩm được.
Câu 7: Trong quá trình tách chiếc DNA cần phải chú ý điều gì?
TL:
+ Thu nhận lượng DNA đủ lớn và tinh sạch.
+ Các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác
nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải
bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ.
+ Tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các
enzyme nội bào.


+ Phân tử DNA có kích thước lớn do đó trong thao tác cần tránh mọi tác
nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này.
Câu 8: Làm thế nào để loại bỏ protein ra khỏi sản phẩm?
TL: Các protein được loại ra khỏi mẫu qua xử lí phenol chloroform và li tâm
Câu 9: Tách chiết acid nucleic có vai trò như thế nào đối với các nghiên
cứu về sinh học phân tử?
TL:
+ Tất cả các nghiên cứu và ứng dụng về sinh học phân tử chỉ được tiến hành
khi có được một lượng acid nucleic đủ lớn, đủ tinh sạch.
+ Tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu về sinh học phân tử, phân loại và
đa dạng di truyền.


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Qua quá trình tìm kiếm và tổng hợp thông tin từ nhiều nguồn tài liệu sinh
học phân tử, kỹ thuật di truyền, trên sơ sở đó, chuyên đề đã tóm tắt lại một số kiến
thức về các loại acid nucleic và quá trình tách chiết, tinh sạch kèm theo đó là ứng
dụng của quy trình này trong thực tế. Bên cạnh đó chuyên đề còn bổ sung một số
câu hỏi thảo luận nhằm giúp người đọc hiểu sâuvà vận dụng kiến thức đã trình bày.
Kiến nghị

Trong khoảng thời gian hạn chế, chuyên đề không thể tránh khỏi những
thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp để đề tài được hoàn
thiện hơn.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×