Tải bản đầy đủ

Chuyên đề điện DI ADN TRÊN GEL AGAROSE và ỨNG DỤNG

HỘI THẢO DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẮC BẮC BỘ

Chuyên đề:
ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE VÀ ỨNG DỤNG

\

1


MỤC LỤC

PHẦN I. MỞ ĐẦU........................................................................................................................... 4
I.

Lý do chọn đề tài....................................................................................................................... 4

II.

Mục đích của đề tài................................................................................................................. 4


III.

Đối tượng, phạm vi áp dụng................................................................................................... 4

PHẦN II. NỘI DUNG...................................................................................................................... 5
A. TÓM LƯỢC LÝ THUYẾT CƠ BẢN........................................................................................5
CHƯƠNG 1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA ADN...............................................5
I.

Cấu trúc và chức năng của ADN................................................................................................5
1. Cấu trúc hóa học của các đơn phân trong ADN........................................................................5
2. Cấu trúc chuỗi polynucleotide...................................................................................................6
3. Cấu trúc không gian của ADN.................................................................................................. 6
4. Chức năng của ADN................................................................................................................. 8

II.

Cấu trúc và chức năng của gen...............................................................................................8

1. Khái niệm gen........................................................................................................................... 8
2. Cấu trúc chung của gen cấu trúc............................................................................................... 8
III.

Các loại ADN.......................................................................................................................... 9

1. ADN độc bản (single - copy ADN)...........................................................................................9
2. ADN lặp (repetitive ADN)......................................................................................................10
CHƯƠNG 2. ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE..................................................................11
I.

Giới thiệu chung về điện di...................................................................................................... 11
1. Khái niệm.............................................................................................................................. 11
2. Nguyên tắc hoạt động........................................................................................................... 11
3. Các loại điện di trên gel........................................................................................................12

II.

Sử dụng enzym giới hạn trong điện di để phân tích ADN....................................................13

1. Khái niệm enzyme giới hạn..................................................................................................13


2. Phân loại enzyme giới hạn....................................................................................................14
III.

Điện di ADN trên gen agarose..............................................................................................16

1. Giới thiệu về gel agarose...................................................................................................... 16
2. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose.........................................................................16
CHƯƠNG III. ỨNG DỤNG CỦA ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE.................................20
I.

Ứng dụng điện di để xác định kích thước, đặc điểm các phân tử ADN...................................20
2


II.

Điện di để tinh sạch và thu nhận mẫu...................................................................................21

III.

Ứng dụng điện di cho Southern Blot....................................................................................21

IV.

Ứng dụng điện di để phân tích các sản phẩm PCR...............................................................22

V. Ứng dụng điện di để phân tích các ADN tiểu vệ tinh và vi vệ tinh..........................................24
B. CÂU HỎI VẬN DỤNG.............................................................................................................26
I. CÂU HỎI TỰ LUẬN.................................................................................................................. 26
II. CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM........................................................................................................38
PHẦN III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................................. 45

3


PHẦN I. MỞ ĐẦU
I.

Lý do chọn đề tài
Trong vòng 20 năm trở lại đây, sinh học phân tử và công nghệ gen đã phát triển mạnh mẽ và
đem lại một trong những thành tựu vĩ đại nhất cho khoa học và công nghệ cuối thế kỉ 20 đầu thế
kỉ 21, đó là phân tích ADN và ARN bộ gen người. Từ đó, sinh học phân tử cũng trở thành công cụ
đắc lực cho nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau như: khảo cổ học, nhân chủng học, di truyền y
học...và đặc biệt trong giám định các vụ án hình sự.
Có nhiều phương pháp khác nhau có thể được sử dụng để phân tích ADN và ARN, nhưng cho
đến nay điện di trên gel là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả nhờ ưu điểm nhanh và
tương đối đơn giản. Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại
phân tử đặc biệt là các acid nucleic và các protein trên cơ sở kích thước khối lượng, điện tích và
cấu hình của chúng.
Trong các loại điện di ADN trên gel thì điện di ADN trên gel agarose là một công cụ được sử
dụng rộng rãi và quan trọng để phân tích các phân tử sinh học. Agarose gel là một loại gel thông
dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn ADN có kích
thước trong khoảng 0.5 – 20 kb. Kỹ thuật này đơn giản và thực hiện nhanh. Hơn nữa, vị trí của
ADN trong gel được xác định trực tiếp: các băng ADN trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp của
thuốc nhuộm huỳnh quang và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
Phương pháp này được ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau như kiểm tra huyết thống,
chẩn đoán bệnh di truyền, gây đột biến điểm, phân tích mẫu ADN cổ, xác định kiểu gene của các
đột biến, so sánh mức độ biểu hiện của gene
Với vai trò quan trọng như thế nên trong các đề thi học sinh giỏi các cấp thường có phần câu
hỏi về điện di. Vì vậy với mong muốn nâng cao chất lượng của học sinh giỏi, cũng như cung cấp
cho giáo viên và học sinh nguồn tư liệu để tham khảo, giảng dạy, học tập và quan trọng hơn hết là
hoàn thiện kiến thức của bản thân về phần phân tích ADN bằng phương pháp điện di, tôi đã chọn
nội dung “Điện di ADN trên gel agarose và ứng dụng” làm đề tài nghiên cứu.
II. Mục đích của đề tài
- Nghiên cứu một số vấn đề chung về cấu trúc và chứa năng ADN
- Nghiên cứu sự về phương pháp điện di ADN trên gel agarose và ứng dụng
- Định hướng tư duy cho học sinh bằng một số bài tập vận dụng.
III. Đối tượng, phạm vi áp dụng
- Giáo viên và học sinh lớp chuyên sinh.
- Giáo viên và học sinh lớp không chuyên, yêu thích môn sinh học.

4


PHẦN II. NỘI DUNG
A. TÓM LƯỢC LÝ THUYẾT CƠ BẢN
CHƯƠNG 1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA ADN
I. Cấu trúc và chức năng của ADN
Axit deoxyribonucleic (ADN) là polyme có phân tử lượng lớn, có mặt trong tất cả tế bào sống.
ADN tập trung chủ yếu ở các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, ngoài ra còn có một số lượng nhỏ
nằm ở ty thể và lục lạp - là các ADN ngoài nhân. Số lượng ADN là không thay đổi trong nhân của
các tế bào cùng loài.
1. Cấu trúc hóa học của các đơn phân trong ADN

a
b
Hình 1. Bốn loại base của ADN (a) và cấu trúc một nucleotide - dAMP (b)
Phân tử ADN được cấu tạo từ các đơn phân là nucleotide. Mỗi nucleotide có 3 thành phần cơ
bản: (1) một đường pentose deoxyribose; (2) một nhóm phosphate và (3) một trong bốn loại base
nitơ. Hai loại base cytosine (X) và thymine (T) có cấu trúc vòng đơn carbon nitrogen được gọi là
các pyrimidine. Hai loại base adenine (A) và guanine (G) có cấu trúc vòng kép (hình 1a). Tên của
các loại base được dùng để đặt tên cho các nucleotide.
Khi một bazơ nitơ liên kết với phân tử đường pentose bằng liên kết β-glycoside sẽ tạo thành
một nucleoside. Liên kết β-glycoside này hình thành giữa nguyên tử carbon thứ nhất (C 1') của
đường pentose với nguyên tử thứ 9 (N9) của bazơ purine hoặc với nguyên tử thứ nhất (N1) của
bazơ pyrimidine. Đồng thời gốc đường pentose cũng nối với nhóm phosphate tại nguyên tử
5


carbon thứ năm (C5') bằng một liên kết phosphomonoester để tạo thành một nucleotit hoàn chỉnh
(hình 1b).
Do có chứa gốc photphat nên các nucleotide thường có tính acid mạnh và tan trong nước.
Các nucleoside monophosphate được xem là các axit đúng như tên gọi phản ảnh. Vì vậy, các
nucleotit có mang điện tích âm.
2. Cấu trúc chuỗi polynucleotide
Các nucleotide trong ADN nối với nhau bằng các mối liên kết cộng hoá trị có tên là liên kết
3',5'-phosphodiester giữa gốc đường của nucleotide này với nhóm phosphate của nucleotide kế
tiếp, tạo thành chuỗi polynucleotide. Vì vậy, các chuỗi này bao giờ cũng được kéo dài theo chiều
5'→3'
(đầu 5' mang nhóm phosphate tự do và đầu 3' chứa nhóm -OH tự do). Chúng có bộ khung vững
chắc gồm các gốc đường và phosphate xếp luân phiên nhau, còn các base nằm về một bên. Trình
tự các base vì vậy được đọc theo một chiều xác định 5'→3'. Đây là cấu trúc hoá học sơ cấp của
ADN (hình 2).

Hình 2. Cấu trúc chuỗi polynucleotide của ADN
3. Cấu trúc không gian của ADN
Năm 1953, J. Watson và F. Crick: tổng hợp các số liệu phân tích hóa học và tán xạ của tia X, để
xây dựng nên mô hình cấu trúc phân tử ADN. Theo mô hình này, phân tử ADN có những đặc
trưng chủ yếu trong cấu trúc không gian như sau:
- ADN gồm hai chuỗi đối song song (antiparallel) một mạch có chiều 3' - 5' và mạch kia có
chiều 5'– 3’, cùng uốn quanh một trục trung tâm theo chiều xoắn phải, với đường kính 20A o
6


(1angstrom = 10-10m) gồm nhiều vòng xoắn lặp lại một cách đều đặn và chiều cao mỗi vòng xoắn
là 34Ao, ứng với 10 cặp base (base pair, viết tắt là bp).
- Các bộ khung đường-phosphate phân bố ở mặt ngoài chuỗi xoắn và các base nằm ở bên
trong; chúng xếp trên những mặt phẳng song song với nhau và thẳng góc với trục phân tử, với
khoảng cách trung bình 3,4Ao.
- Hai sợi đơn gắn bó với nhau bằng các mối liên kết hydro (vốn là lực hóa học yếu) được hình
thành giữa các cặp base đối diện theo nguyên tắc bổ sung "một purine - một pyrimidine". Cụ thể
là, trong ADN chỉ tồn tại hai kiểu kết cặp base đặc thù là A-T (với hai liên kết hydro) và G-C (với
ba liên kết hydro).

Hình 3. Cấu trúc không gian của ADN theo mô hình J. Watson và F. Crick
- Tính chất bổ sung theo cặp base dẫn đến sự base giữa hai sợi đơn của mỗi chuỗi xoắn kép. Vì
vậy, trong ADN sợi kép bao giờ cũng có: A = T và G = C (quy luật Chargaff); nghĩa là (A+G) =
(T+C) hay tỷ số (A+G)/ (T+X) = 1, còn tỉ lệ (A+T)/ (G+X) đặc thù cho từng loài.
Ngoài mô hình của J.Oatxơn, F.Cric nói trên đến nay người ta còn phát hiện ra 4 dạng nữa đó là
dạng A, C, D, Z các mô hình này khác với dạng B (theo J.Watson, F.Crick) ở một vài chỉ số: số
cặp nuclêôtit trong một chu kỳ xoắn, đường kính, chiều xoắn...
Ở một số loài virut và thể ăn khuẩn ADN chỉ gồm một mạch pôlinuclêôtit. ADN của vi khuẩn,
ADN của lạp thể, ti thể lại có dạng vòng khép kín.
4. Chức năng của ADN
ADN có 2 chức năng: vừa lưu giữ và bảo quản thông tin di truyền vừa truyền thông tin di
truyền qua các thế hệ.
7


a. ADN lưu giữ và bảo quản thông tin di truyền
– Thông tin di truyền tức thông tin về cấu trúc của các phân tử prôtêin được mã hóa trong ADN
dưới dạng trình tự các bộ ba nulêôtit kế tiếp nhau, trình tự này qui định trình tự sắp xếp của các
axit amin trong phân tử prôtêin được tổng hợp.
– Mỗi đoạn của phân tử ADN mang thông tin qui định cấu trúc của một loại prôtêin được gọi là
gen cấu trúc. Bình thường, một gen cấu trúc chứa khoảng từ 600 đến 1500 cặp nuclêôtit.
b. ADN truyền thông tin di truyền qua các thế hệ
– ADN có khả năng tự nhân đôi và phân li. Sự nhân đôi và phân li của ADN kết hợp với nhân
đôi và phân li của nhiễm sắc thể trong phân bào là cơ chế giúp sự truyền thông tin di truyền từ tế
bào này sang tế bào khác, từ thế hệ cơ thể này sang thế hệ cơ thể khác.
– ADN còn có khả năng sao mã tổng hợp ARN và qua đó điều khiển giải mã tổng hợp prôtêin.
Prôtêin được tổng hợp tương tác với môi trường thể hiện tính trạng của cơ thể.
II. Cấu trúc và chức năng của gen
Nhiễm sắc thể chứa ADN là cấu trúc mang gen. Gen được truyền từ bố mẹ sang con cái và
được xem là đơn vị cơ bản của sự di truyền, ảnh hưởng lên mọi cấu trúc và chức năng của cơ thể.
1. Khái niệm gen
Gen là một đoạn xác định của phân tử ADN (một số virut là ARN) có chức năng di truyền nhất
định – một chuỗi pôlipeptit hay một phân tử ARN.
Ở tế bào nhân thực ngoài các gen nằm trên NST trong nhân tế bào còn có các gen nằm trong
các bào quan ở tế bào chất.
2. Cấu trúc chung của gen cấu trúc

Hình 4. Cấu trúc chung của gen cấu trúc
- Mỗi gen mã hóa cho prôtêin điển hình gồm 3 vùng trình tự nuclêôtit:
+ Vùng điều hòa nằm ở đầu 3' mạch mã gốc của gen mang tín hiệu khởi động và kiểm soát
phiên mã.
+ Vùng mã hóa mang thông tin mã hóa cho các axit amin.
+ Vùng kết thúc nằm ở đầu 5' mạch mã gốc của gen, mang tín hiệu kết thúc phiên mã.
Vùng mã hóa có cấu trúc phân mảnh hoặc không phân mảnh tùy thuộc vào sinh vật. Các gen
của sinh vật nhân sơ có vùng mã hóa liên tục. Phần lớn các gen của sinh vật nhân thực có vùng
mã hóa không liên tục. Xen kẽ giữa các đoạn mã hóa axit amin (exon) là các đoạn không mã hóa
axit amin (intron). Các gen như vậy gọi là gen phân mảnh. Số lượng exon và intron của các gen
khác nhau là khác nhau.
Ở sinh vật nhân sơ có vùng mã hóa liên tục (gen không phân mảnh)
8


Ở sinh vật nhân thực có vùng mã hóa không liên tục: xen kẽ các đoạn mã hóa axit amin (exôn)
là các đoạn không mã hóa axit amin (intron). Vì vậy, các gen này được gọi là gen phân mảnh.

a
b
Hình 5. Gen không phân mảnh ở sinh vật nhân sơ (a) và gen và gen phân mảnh ở sinh vật
nhân thực (b)
Cấu trúc intron và exon của gene là một đặc điểm để phân biệt giữa ADN của sinh vật
eukaryote và prokaryote. Các intron chiếm phần lớn trong cấu trúc hầu hết các gene của cơ thể
eukaryote. Các đoạn intron này sẽ được các enzyme cắt một cách chính xác ra khỏi các phân tử
mARN trước khi chúng đi ra khỏi nhân tế bào. Vị trí cắt của các enzyme được xác định bởi các
đoạn ADN được gọi là các đoạn đồng nhất (consensus sequences) (đoạn này có tên như vậy vì
được thấy phổ biến ở tất cả các cơ thể eukaryote) nằm cạnh mỗi đoạn exon (hình 5).
III. Các loại ADN
Mặc dù ADN mang thông tin mã hóa cho các protein nhưng trong thực tế chỉ có ít hơn 5%
trong số 3 tỷ cặp nucleotide trong genome của người thực sự làm chức năng này, còn lại phần lớn
vật liệu di truyền chưa được biết chức năng. Người ta chia ADN thành các loại ADN độc bản và
ADN lặp.
1. ADN độc bản (single - copy ADN)
ADN độc bản chiếm khoảng 45% genome và gồm các gene mã hoá cho các protein. Các đoạn
ADN loại này chỉ được thấy một lần duy nhất (hoặc vài lần) trong genome. Tuy nhiên phần mã
hóa cho protein chỉ chiếm một phần nhỏ trên loại ADN này mà thôi, phần lớn còn lại là các intron
hoặc là các đoạn ADN nằm xen giữa các gene.
2. ADN lặp (repetitive ADN)
ADN lặp chiếm 55% còn lại của genome, đây là các đoạn ADN được lặp đi lặp lại có thể lên
tới hàng nghìn lần trong genome, có 2 loại chính:
9


* ADN vệ tinh (satellite ADN): Loại ADN này chiếm khoảng 10% genome và tập trung ở một
số
vùng nhất định trên NST, ở đó chúng sắp xếp nối đuôi nhau, cái này tiếp theo cái kia. ADN vệ
tinh được chia thành 3 loại nhỏ:
- ADN vệ tinh alpha: có kích thước 171bp, lặp đi lặp lại nhiều lần với chiều dài hàng triệu bp
hoặc hơn. Loại này được thấy cạnh tâm động của NST.
- ADN tiểu vệ tinh (minisatellite ADN): Đó là các trình tự base lõi lặp lại có kích thước từ 14 500 bp, lặp đi lặp lại với chiều dài thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB). Các
tiểu vệ tinh này hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đa vị trí; hay chỉ có tại
một vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đơn vị trí.
- ADN vi vệ tinh (microsatellite ADN): Là các trình tự có có kích thước nhỏ từ 1 - 13 bp, lặp lại
nhiều lần (từ 10 đến 60 lần) với tổng chiều dài dưới 1000 base. Do kích thước nhỏ nên các trình
tự này còn được gọi là các STRs (Short TADNem Repeats, các trình tự lặp lại).
Hai loại ADN tiểu và vi vệ tinh có sự khác nhau rất lớn trong chiều dài giữa người này với
người khác và điều này làm chúng trở nên rất hữu ích trong việc lập bản đồ gene. ADN tiểu vệ
tinh và vi vệ tinh được gặp với tần số trung bình là 1 trên mỗi 2kb trong genome và chúng chiếm
khoảng 3% genome.
* ADN lặp lại rải rác: Loại ADN này chiếm khoảng 45% genome, gồm 2 loại:
- Các yếu tố rải rác có kích thước ngắn (SINEs: short interspersed elements): kích thước từ 90
đến 500bp.
- Các yếu tố rải rác có kích thước dài (LINEs: long interspersed elements): kích thước
7.000bp.
Các trình tự base lặp lại hầu như không mang những mã có ý nghĩa chức năng. Cũng như các
trình tự base có ý nghĩa chức năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từ cha
mẹ sang con cái theo quy luật di truyền. Tuy nhiên khác với gen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về
trình tự base của gen giữa các cá nhân, có khá nhiều trình tự base lặp lại giúp có thể giúp phân
biệt được cá nhân này với các nhân khác, và chẳng những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan
hệ huyết thống với nhau hay không. Các trình tự base lặp lại này được gọi là các dấu vân tay
ADN.

10


CHƯƠNG 2. ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE
I. Giới thiệu chung về điện di
1. Khái niệm
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện
trường. Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz.
Nhiều phương pháp nghiên cứu về phân tử ADN đều liên quan đến điện di trên gel.
Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân
tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước,
hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point).
2. Nguyên tắc hoạt động

a
b
Hình 6. Nguyên tắc điện di (a) và Hệ thống điện di dung dịch (b)
Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản
gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau (ethidium
bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Nguyên tắc của phương pháp là khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường,
chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.
Khác với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid luôn có
điện tích âm nhờ khung phosphate của nó và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương. Các
phân tử ADN khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng
hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode)
với tốc độ di chuyển khác nhau. Vì vậy, chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di, qua đó
người ta có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạn ADN hoặc gen riêng rẽ. Trên điện
trường các phân đoạn ADN có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển càng nhanh và ngược
lại.

11


Độ linh động hoặc tốc độ chuyển động của phân tử
tăng lên khi hiệu điện thế và điện tích của phân tử tăng
lên và ngược lại độ linh động giảm khi ma sát giữa các
phân tử hoặc độ nhớt của môi trường tăng làm cản trở
dòng di chuyển.
Sau khi điện di kết thúc, các phân tử ADN có thể quan
sát thấy nhờ sử dụng các thuốc nhuộm phát huỳnh quang,
chẳng hạn như ethidium (chất này gắn kết với ADN bằng
cách cài vào khe ở giữa các nucleotit). Mỗi một băng điện
di thường phản ánh một tập hợp các phân tử ADN có
cùng kích thước (hình 7).
Hình 7. Minh họa kết quả hình
3. Các loại điện di trên gel
ảnh điện di
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy
điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất.
Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp mẫu. Gel được ngâm
trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở
một giá trị không đổi tương đối.
Gel được cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống
mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử và phản ứng tạo
liên kết chéo. Các kiểu điện di:

Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50bp – 20kb


Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb



Ngoài ra còn điện di trong trường xung (PFGE _ Pulse Field Gel Electrophonesic)

Trong đó, gel polyacrylamid có khả năng phân tách cao, nhưng khoảng kích thước ADN có thể
phân tích hẹp. Vì vậy, điện di trên gel polyacrylamid có thể phân tách được các phân đoạn ADN
khác nhau thậm trí chỉ một cặp nucleotit (1 bp) duy nhất, nhưng thường chỉ để phân tích các đoạn
ADN kích thước vài trăm bp. Còn gel agarose có khả năng phân tách thấp hơn đối với các phân
đoạn ADN kích thước nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân tách các phân đoạn ADN kích thước lớn
tới hàng chục hoặc hàng trăm kb (1 kb = 1000 bp).
Các phân đoạn ADN kích thước lớn không thể “lọt” qua các lỗ có kích thước nhỏ trên các bản
gel, kể cả gel agarose. Thay vào đó, chúng sẽ “trườn” qua mạng lưới của gel bằng việc đầu này
của phân tử đi trước, còn đầu kia theo sau. Kết quả là các phân đoạn ADN kích thước lớn (từ 30
đến 50 kb) có tốc độ di chuyển trên điện trường gần như tương đương và khó phân tách được
bằng phương pháp điện di thông thường. Đối với các phân đoạn ADN kích thước lớn như vậy,
12


người ta có thể phân tách bằng việc sử dụng phương pháp điện di xung trường (pulsed-field gel
electrophoresis). Trong phương pháp này, người ta sử dụng 2 cặp điện cực nằm chéo góc trên bản
điện di. Việc “bật” và “tắt” luân phiên 2 cặp điện cực sẽ làm cho các phân đoạn ADN lớn thay đổi
chiều di chuyển. Các phân đoạn ADN có kích thước càng lớn càng chậm hơn trong quá trình thay
đổi chiều di chuyển. Nhờ vậy, các phân đoạn có kích thước khác nhau sẽ phân tách ra khỏi nhau
trong quá trình di chuyển. Kỹ thuật điện di xung trường trong thực tế có thể sử dụng để xác định
được kích thước đầy đủ của nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc nhiễm sắc thể các loài sinh vật nhân
chuẩn bậc thấp, như nấm men. Những loài này có kích thước hệ gen khoảng vài Mb.
Điện di không những có thể phân tách các phân đoạn ADN khác nhau về kích thước mà cả về
hình dạng và cấu hình không gian của chúng. Các phân tử ADN ở dạng mạch vòng giãn xoắn
hoặc bị “đứt gãy” ở một số nucleotit di chuyển chậm hơn trên trường điện di so với các phân tử
ADN ở dạng mạch thẳng có cùng khối lượng. Tương tự như vậy, các phân tử ADN ở dạng siêu
xoắn, kích thước và thể tích thu nhỏ thường di chuyển nhanh hơn trên trường điện di so với các
phân tử ADN dạng mạch vòng giãn xoắn hoặc có mức độ cuộn xoắn thấp hơn có cùng khối
lượng.
Như vậy, các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốc
khác nhau nhờ vào sự khác nhau của:

Lực điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau)


Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel



Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

II. Sử dụng enzym giới hạn trong điện di để phân tích ADN
Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và
phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm. Trong các tế bào, phần lớn các nhiễm sắc
thể thường là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau. Vì vậy, để
có thể phân lập và phân tích từng gen, người ta phải cắt các phân tử ADN kích thước lớn thành
các phân đoạn nhỏ. Công việc này được thực hiện bởi một nhóm các enzym đặc biệt gọi là enzym
giới hạn.
1. Khái niệm enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết
điểm cắt ADN đặc hiệu. Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ
khung ADN mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases. Các liên kết hóa học mà bị enzyme này
cắt có thể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phân đoạn giới
hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gene khác nhau có thể
được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau. Nhiều kỹ thuật sinh học phân
tử và kỹ thuật di truyền đều dựa vào các enzyme giới hạn.
13


Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc các enzyme này được khám phá từ các chủng E. coli mà
đang hạn chế sự phát triển của các thực khuẩn thể. Vì thế enzyme giới hạn được cho là cơ chế của
vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công của virus và giúp loại bỏ các trình tự của virus.
2. Phân loại enzyme giới hạn
Enzyme cắt giới hạn được chia thành ba loại là Loại I, Loại II và Loại III. Đối với hai loại I và
III, cả hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một
phức hợp enzyme lớn. Mặc dù những enzyme thuộc hai loại này cũng nhận biết những trình tự
ADN đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base. Chúng cũng cần
ATP để hoạt động. Những enzyme này bắt đầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2
adenine trong vùng nhận biết. Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho thấy
đây là ADN ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải. Tuy
nhiên, nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là ADN của tế bào, enzyme khi đó sẽ
thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc adenine còn lại để duy trì sự ổn định
cho ADN bộ gene. Với enzyme giới hạn loại II, chức năng phân giải của nó không liên quan đến
chức năng methyl hóa hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kế
cận vị trí nhận biết.
Bảng 1. Điểm khác nhau giữa 3 loại enzim cắt giới hạn
Đặc điểm
Điểm cắt
Khả năng metyl hoá
gốc Adenin
Điều kiện để cắt
Cấu trúc của enzim
(Số chuỗi polipeptid)

Loại I
Cách xa điểm nhận biết
(trên 1000bp)


Loại II
Nằm trong điểm
nhận biết
Không

Loại III
Nằm ngoài điểm nhận
biết (gần hơn loại I)


ATP,Mg++, S-AdoMet
3 chuỗi khác nhau

Mg++ hoặc Mn++
2 chuỗi giống
nhau

Mg ++, S-AdoMet
2 chuỗi khác nhau

Ngày nay, người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại II và chúng là một trong những công
cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân
tích ADN nhờ vị trí và trình tự cắt của chúng được xác định rõ. Các trình tự giới hạn của enzym
nhóm II thường gồm 4 - 8 bp, thông thường có tính đối xứng và vị trí cắt thường nằm trong trình
tự giới hạn này. Ví dụ như enzym giới hạn EcoRI được tìm thấy ở vi khuẩn E. coli có trình tự giới
hạn là 5’-GAATTC-3’ với vị trí cắt ở giữa G và A. Tên enzym gồm 3 ký tự đầu chỉ tên loài vi
khuẩn mà từ đó enzym được tìm thấy (Eco = Escherichiacoli), các ký tự sau chỉ tên của chủng vi
khuẩn và số thứ tự của enzym được tìm thấy ở loài vi khuẩn đó (EcoRI là enzym giới hạn đầu tiên
được tìm thấy ở E. coli).

14


Giả sử có một phân tử ADN mạch thẳng có 6 vị trí cắt của enzym EcoRI. Việc cắt phân tử ADN
này bằng EcoRI sẽ cho ra 7 phân đoạn ADN khác nhau. Do đó, khi điện di trên gel sản phẩm cắt,
7 phân đoạn ADN sẽ phân tách nhau ra do chúng khác nhau về khối lượng (vì chúng khác nhau về
thành phần và trình tự các nucleotit). Như vậy, một phân đoạn ADN sẽ tương ứng với một vùng
của phân tử ADN ban đầu.
Việc sử dụng một enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII cũng có trình tự giới hạn gồm 6 bp,
nhưng có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT-3’) sẽ cho ra các sản phẩm cắt khác với khi sử
dụng EcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu). Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới
hạn sẽ tạo ra một kiểu hình phổ điện di các phân đoạn cắt giới hạn đặc thù đối với từng gen phân
tích.
Đối với một số enzym giới hạn
khác, chẳng hạn như Sau3A1 (ở vi
khuẩn Staphylococcusaureus)

trình tự giới hạn ngắn hơn (5’GATC-3’), nên tần số cắt của chúng
thường cao hơn các enzym có trình
tự giới hạn dài. Theo xác
suất, Sau3A1 có trung bình 1 vị trí
cắt trong một đoạn trình tự khoảng
250 bp (1/44 = 1/256). Ngược lại,
enzym NotI có trình tự giới hạn dài
(5’-GCGGCCGC-3’) trung bình cứ
một đoạn trình tự dài khoảng 65 kb,
mới có 1 vị trí cắt (1/48 = 1/65536).
Các enzym giới hạn không chỉ
Hình 8. Enzim cắt giới hạn đầu dính và đầu bằng
khác nhau về trình tự giới hạn và độ
dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng của chúng, mà chúng còn khác nhau về cách “cắt” phân tử
ADN. Chẳng hạn như enzym HpaI và EcoRV tạo ra các phân tử ADN dạng đầu bằng (đầu tù), còn
các enzym EcoRI, HindIII và PstI cắt phân tử ADN tạo ra các phân đoạn có đầu dính (hình 8).
Gọi là “đầu dính” bởi phần các trình tự ở hai đầu sau khi được enzym cắt ra bổ trợ với nhau theo
nguyên tắc Chargaff và vì vậy chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, hoặc với các phân tử
ADN được cắt bởi cùng một loại enzym giới hạn. Tính chất này được ứng dụng rộng rãi trong
công nghệ ADN tái tổ hợp và các kỹ thuật tách dòng phân tử.

15


III. Điện di ADN trên gen agarose
1. Giới thiệu về gel agarose
Agarose là một polysaccharide, thường được
chiết xuất từ rong biển nhất định. Nó là một
polymer tuyến tính được tạo thành từ đơn vị lặp đi
lặp lại của agarobiose, là một disaccharide tạo thành
từ D -galactose và 3,6-anhydro- L -galactopyranose
(hình 9). Agarose là một trong hai thành phần chính
của thạch và được tinh chế từ thạch bằng cách loại
Hình 9. Cấu trúc phân tử của agarose.
bỏ thành phần khác của agar, agaropectin.
Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar,
được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100 oC và sau
đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 oC. Polyme agarose có thể chứa tới 100 đơn
vị monomer, với khối lượng phân tử trung bình vào khoảng 10000 Da. Agarose có cấu trúc dạng
lưới ba chiều các kênh có đường kính từ 50 nm đến > 200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose
được sử dụng - nồng càng độ cao đường kính lỗ càng nhỏ. Cấu trúc 3-D được tổ chức cùng với
liên kết hydro và do đó có thể bị gián đoạn do làm nóng trở lại trạng thái lỏng.
Vì có cấu trúc dạng lưới phù hợp nên agarose thường được sử dụng trong sinh học phân tử để
tách các phân tử lớn, đặc biệt là ADN, bằng điện di. Các tấm gel agarose (thường là 0,7 - 2%) đối
với điện di được chuẩn bị dễ dàng bằng cách đổ dung dịch ấm, lỏng vào khuôn. Một loạt các
agaroses khác nhau của trọng lượng phân tử khác nhau và tài sản là thương mại có sẵn cho mục
đích này. Agarose cũng có thể được hình thành thành các hạt và được sử dụng trong một số
phương pháp sắc ký để làm sạch protein.
Đoạn ADN mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel
chứa các nồng độ agarose khác nhau. Do đó, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách
được các đoạn ADN có kích thước khác nhau. Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các
đoạn ADN nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn ADN lớn hơn.
2. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose
2.1. Chuẩn bị gel agarose
Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong
thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic). Nó dễ dàng chảy ra và
tạo thành một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp. Tuy
nhiên, type-II-agarose dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các
enzyme như ligase, polymerase và RE. Vì thế, các đoạn ADN dung ly từ những gel như thế phải

16


được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các
enzyme này.
* Đệm pH
Một số đệm điện di thích hợp cho ADN sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE),
Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,57,8. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn
(conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự
dịch chuyển cần thiết của ADN trong gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ:
dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó.
* Các bước chuẩn bị gel agarose như sau:
- Cho lượng thích hợp agarose và
dung dịch đệm vào bình tam giác.
- Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút
trong nồi hấp cao áp ở 115°C hoặc
bằng vi sóng. Chú ý khi dùng lò vi
sóng cần quan sát để tránh trào gel ra
ngoài, nên chờ đến khi gel sôi thì cắt
điện, lấy ra, lắc đều rồi cho vào làm sôi
lần nữa. Lặp lại ba lần cho agarose tan
hoàn toàn.
- Cho vào chậu cho đến khi dịch gel
Hình 10. Chuẩn bị gel agarose
đạt đến khoảng 50 – 60oC thì cho vào
gel một lượng dung dịch ethidium bromide để có hàm lượng cuối cùng của chất màu này là 50
μg/ml. (Nếu không cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel vào khuôn thì ngâm bản
gel vào dung dịch này sau khi đã điện di).
- Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược và đặt
trên mặt phẳng
- Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel.
2.2. Tiến hành điện di
- Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang, rót dung
dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cực âm.
- Một hỗn hợp các phân tử ADN, thường là các đoạn cắt giới hạn hoặc là sản phẩm PCR cần
điện di pha với dung dịch màu tải mẫu 6× hoặc bằng hợp chất màu tương tự. Dịch màu có tỷ
trọng cao này giúp nucleic acid không bị xáo động bởi dòng đối lưu của dung dịch nên khi tải vào

17


lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ ràng. Dung dịch màu tải mẫu 6× chứa 30%
glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC).
- Bằng micropipet hút mẫu ADN, mỗi mẫu là một hỗn hợp nhiều phân đoạn ADN khác nhau
được tra vào các giếng riêng biệt (các lỗ răng lược) ở đầu mỗi bản gel (hình 11).

Hình 11. Tra dung dịch chứa các phân đoạn ADN vào các giếng
- Bật dòng điện một chiều để thực hiện điện di. Cường độ dòng điện khoảng 50 đến 150 V tùy
loại thiết bị điện di. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của ADN, nồng độ agarose
của gel và cường độ dòng điện.
2.3. Nhuộm ADN trong agarose gel bằng EtBr
Phương pháp quan sát ADN trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang
EtBr. Thuốc nhuộm này phát huỳnh quang màu hồng dưới nguồn ánh sáng cực tím, cho phép phát
hiện các băng ADN riêng rẽ. Vì sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và
cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Mặc dù tính linh động điện di của ADN sợi đôi
mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp
dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở
giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt.
Cách nhuộm: Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ
bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr
nồng độ 0,5% trong thời gian 30-45 phút, tốt nhất
trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút). Đổ dịch
nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản
18

Hình 12. Cấu trúc ethidium bromide


gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵn ở dạng đậm
đặc 5 mg/mL và giữ ở 4oC trong tối.
2.4. Kiểm tra băng ADN
- Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng có bước sóng 302nm. Dùng thiết bị
chuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh ADN (Gel Documentation System).
- Nếu điện di ADN trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại (UV) nucleid
acid sẽ hiện ra dưới dạng những vạch màu đỏ cam. Mỗi băng chứa hàng nghìn phân tử đoạn ADN
có kích thước giống nhau.

Hình 13. Kiểm tra băng ADN dưới ánh sáng UV
- Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel 30 - 60 phút trong
dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml.
- Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh
sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bị phân tích gel số hóa (gel documentation
system).

Hình 14. Hệ thống máy chụp ảnh điện di

Hình 15. Kết quả điện di trên gel agarose
chụp bằng ánh sáng UV

19


20


CHƯƠNG III. ỨNG DỤNG CỦA ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE
Điện di ADN được ứng dụng trong nhiều phân tích để trả lời các nghi vấn sinh học khác nhau.
Dưới đây là một số ứng dụng phổ biến.
I. Ứng dụng điện di để xác định kích thước, đặc điểm các phân tử ADN
Kích thước của phân tử ADN có thể được xác định bởi so sánh kích thước của đoạn ADN đã
biết. Đoạn ADN đã biết kích thước được phân tách trên gel agarose 0.8% cùng với mẫu chưa biết.
Giá trị di chuyển tương đối (Rf) của mỗi băng ADN được tính từ gel agarose. Giá trị di chuyển
tương đối và kích thước của ADN được sử dụng để vẽ đường cong chuẩn hóa để tính kích thước
của mẫu ADN chưa biết.
Một ứng dụng hữu ích của kỹ thuật này là phân tích các đoạn giới hạn, chúng có thể nhanh
chóng cung cấp các thông tin có ích về trình tự ADN. Trong kiểu phân tích này người ta cắt phân
tử ADN bằng enzim cắt giới hạn, sau đó các đoạn ADN được phân tách trên gel điện di. Khi hỗn
hợp dịch chuyển qua trường điện di nó tạo nên một kiểu băng đặc trưng cho phân tử ADN gốc
ban đầu.
Việc phân tích các đoạn giới hạn cũng rất hữu ích cho so sánh hai phân tử ADN khác nhau, đặc
biệt là so sánh hai alen của cùng một gen. Một enzim giới hạn nhận ra một trình tự đặc thù và
thậm chí chỉ cần một thay đổi ở một cặp bazơ trên trình tự đó cũng đủ để bảo vệ nó không bị cắt.
Vì vậy, nếu hai alen khác nhau về các nucleotit trong vị trí giới hạn thì việc xử lý bằng enzim
nhận biết ra trình tự đó sẽ tạo nên hai hỗn hợp các đoạn khác nhau tương ứng với hai alen. Mỗi
hỗn hợp như thế lại tạo nên các băng điện di riêng như ví dụ về đột biến bệnh hồng cầu lưỡi liềm
hình 16 dưới đây.

Hình 16.
A. Các vị trí giới hạn của Ddel ở alen bình
21

B. Điện di các đoạn giới hạn bắt nguồn


thường và alen đột biến hình lưỡi liềm thuộc
từ alen bình thường và alen đột biến
gen β-globin
hình lưỡi liềm thuộc gen β-globin
II. Điện di để tinh sạch và thu nhận mẫu
Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng
điện trường thay đổi thì phân tử ADN phải tự định hướng lại. Sau khi điện di các vạch tương ứng
với ADN cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại theo một trong những phương pháp:
 Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và ADN được thu nhận sau khi
đã khuếch tán phân tử gel agarose vào một dung dịch đệm thích hợp.
 Phương pháp 2: một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trước vạch ADN. “giếng”
này được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được tái lập. ADN di chuyển vào giếng chứa
đầy dung dịch đệm và được thu nhận lại.
 Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc biệt (như Nusieve hay
Seaplaque) có điểm nóng chảy rất thấp (65°). Sau điện di vạch ADN được cắt ra, ủ trong một
dung dịch đệm ở 65°. Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy, ADN được thu nhận lại sau nhiều công
đoạn tách chiết và tủa.
III. Ứng dụng điện di cho Southern Blot
Southern blot là quá trình chuyển các phân tử ADN từ gel agarose lên một màng và nhờ đó
giúp các nhà nghiên cứu định vị trình tự ADN bên trong một hỗn hợp phức tạp. Southern Blot có
thể được sử dụng để xác định vị trí một gen cụ thể trong toàn bộ hệ gen.

22


Hình 17. Các bước trong kỹ thuật Southern Blot
Trong kỹ thuật Southern Blot, ADN hệ gene được cắt với Enzyme cắt giới hạn EcoRI hoặc
BamHI để cắt những sợi ADN có khối lượng phân tử lớn thành những đoạn nhỏ hơn và các đoạn
ADN được điện di trên thạch agarose (agarose gel) để phân tách chúng theo kích thước. Nếu
những đoạn ADN nào kích thước lớn hơn 15kb, thì trước khi thẩm tách, gel có thể được xử lý bởi
acid (như HCl loãng). Cách này loại bỏ các đoạn ADN lớn, bẻ gãy chúng thành những mảnh nhỏ,
do đó cho phép sự dịch chuyển hiệu quả hơn từ gel tới màng Gel này được ủ với dung dịch kiềm
để biến tính sợi đôi ADN thành sợi đơn. Một tấm màng nitrocellulose (hoặc nylon thay thế) được
đặt bên trên (hoặc dưới, tùy thuộc vào hướng di chuyển) gel. Áp lực được áp dụng đồng đều trên
gel (hoặc dùng cách hút, hoặc đặt một chồng giấy và một khối lượng lên bên trên màng và gel,
nhằm đảm bảo sự tiếp xúc tốt và đồng đều giữa gel và màng. ADN được chuyển lên màng
nitrocellulose bởi hoạt động mao dẫn bằng áp dụng một áp suất đồng nhất hoặc bởi áp suất hút
hoặc bởi đặt khăn giấy ướt. Màng sau đó được nung trong chân không hoặc trong lò thông
thường ở 80°C trong 2 giờ để gắn vĩnh viễn ADN-di chuyển lên màng. Màng sau đó được tiếp
xúc với đầu dò lai ghép (hybridization probe) - một đoạn ADN đơn với một trình tự đặc biệt, có
xuất hiện trong trình tự ADN đích, để được xác định. Đầu dò ADN (ADN probe) được đánh dấu
nhằm để được phát hiện, bằng cách liên kết với phóng xạ hoặc gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang
hoặc sắc tố nhuộm. Trong vài trường hợp, đầu dò lai ghép có thể được tạo từ ARN chứ không
23


phải ADN. Để đảm bảo tính đặc hiệu của liên kết giữa đầu dò với ADN mẫu, hầu hết các phương
pháp lai phổ biến đều dùng ADN tinh trùng cá hồi hoặc cá trích để chặn bề mặt màng và ADN
đích, formamide bị khử ion hóa, và các chất tẩy như SDS để giảm liên kết không đặc hiệu của đầu
dò. Sau khi lai, đầu dò dư thừa được rửa sạch khỏi màng (thường sử dụng bộ đệm SSC) và mô
hình lai được hiển thị trên phim X quang bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi trong trường hợp đầu dò
phóng xạ hoặc huỳnh quang, hoặc bằng cách phát triển màu trên màng nếu sử dụng phương pháp
phát hiện sắc ký.
Từ kết quả "lai" có thể xác định và phân lập được đoạn ADN mong muốn và có thể xác định
được các cá thể mang gen đột biến liên quan đến các bệnh di truyền.
IV.
Ứng dụng điện di để phân tích các sản phẩm PCR
PCR là từ viết tắt của Polymerase Chain Reaction nghĩa là phản ứng chuỗi polymerase cũng
có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử
nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật sống
như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh
nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
(1) Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi ADN ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ
cầu nối hydrogen nối 2 sợi ADN. Trước chu kỳ 1, ADN thường được biến tính đến thời gian mở
chuỗi để đảm bảo mẫu ADN và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời
gian: 1-2

24


phút.
(2) Sau khi 2 sợi ADN tách ra,
nhiệt độ được hạ thấp xuống để
mồi có thể gắn vào sợi ADN đơn.
Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ
giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn
mồi và thường thấp hơn nhiệt độ
biến tính 50 °C (45-60 °C). Sử
dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn
này dẫn đến việc đoạn mồi không
gắn hoàn toàn vào ADN mẫu, hay
gắn một cách tùy tiện. Thời gian:
1-2 phút.
(3) Cuối cùng, ADN polymerase
gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu
bám vào và hoạt động dọc theo
sợi ADN. Bước này gọi là kéo dài.
Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc ADNpolymerase. Thời gian của bước
này phụ thuộc vào cả ADNpolymerase và chiều dài mảnh
ADN cần khuếch đại. Như một
quy tắc …, 1000bp/ 1 phút.
Sản phẩm PCR sau đó được
quan sát bằng kỹ thuật điện di
ADN trên gel agarose. Chất
nhuộm ADN có trong gel agarose
sẽ bám vào các sản phẩm PCR khi
những phân tử này di chuyển
trong gel dưới tác dụng của điện
Hình 18. Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp
trường. Dưới ánh sáng cực tím
khuếch đại gen – PCR
(UV) chất nhuộm ADN sẽ phát
quang và cho phép xác định được vị trí của sản phẩm PCR. Khi so sánh với vị trí của các đoạn
ADN chuẩn biết trước kích thước, kỹ thuật viên sẽ biết được kích thước của sản phẩm PCR và kết
luận được trong mẫu ADN ban đầu có chứa ADN mục tiêu hay không.
25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×