Tải bản đầy đủ

chuyên đề “ một số ứng dụng của sinh học phân tử”

CHUYÊN ĐỀ:

MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ

1


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay, di truyền học đã, đang và tiếp tục đ ược nghiên c ứu và ứng
dụng vào rất nhiều lĩnh vực của khoa học và thực tiễn. Trong các ứng dụng
của di truyền học, theo tôi, ứng dụng của Sinh học phân t ử là r ất đa d ạng,
phong phú và cũng có nhiều mới mẻ, hiện đại. Việc lựa chọn và biên t ập
những nội dung cần thiết, những ứng dụng quan trọng, có tính m ới và c ập
nhật, vừa là cập nhật với những nghiên cứu mới, vừa tiếp cận với yêu cầu
của các đề thi học sinh giỏi các cấp, sẽ giúp h ọc sinh có một cái nhìn t ổng
quát hơn, tiếp cận sâu hơn với kiến thức về di truy ền phân t ử nói riêng và
di truyền học nói chung. Với lý do đó, tôi viết chuyên đề: “ Một số ứng
dụng của Sinh học phân tử” nhằm hướng học sinh tiếp cận những ứng
dụng quan trọng đã được nghiên cứu, đang nghiên cứu và tiếp tục nghiên
cứu trên cơ sở ứng dụng những hiểu biết về Sinh học phân tử.

2. Mục đích của đề tài
Đề tài đã đề cập đến những ứng dụng quan trọng đã, đang và ti ếp t ục
được nghiên cứu của di truyền học phân tử. Vì vậy, tôi viết đề tài này
trước hết là để giúp mình thống kê một cách đầy đủ, logic v ới n ội dung
này trong giảng dạy; sau là để chia sẻ với h ọc sinh không ch ỉ ki ến th ức v ề
ứng dụng di truyền học phân tử mà cả hướng nghiên cứu, tìm tòi và phát
triển nội dung bài học.

2


PHẦN NỘI DUNG
I. LAI PHÂN TỬ
1. Lai phân tử là gì?
Khi một phân tử ADN mạch đôi được đun lên một nhiệt độ v ượt quá
“nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá v ỡ các
liên kết hidro nối liền hai mạch.
Nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột thì sự bắt c ặp sẽ không x ảy
ra. Lúc đó phân tử ADN sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đ ơn d ưới
một cấu hình vô trật tự.
Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ đ ược làm gi ảm t ừ t ừ
cộng với điều kiện thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này
được gọi là lai phân tử.
Hai mạch ADN có nguồn gốc khác nhau nhưng có trình tự nucleotit bổ
trợ có thể liên kết với nhau trong điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, đ ộ pH,
nồng độ muối trong đệm) để tạo nên một phân tử ADN mới. Hiện tượng
liên kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch ADN với nhau, hoặc
giữa hai mạch ARN hoặc giữa ADN và ARN. Phân tử axit nucleic s ợi kép
mới hình thành được gọi là phân tử lai và quá trình kết c ặp gi ữa các baz ơ
thuộc hai mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác nhau theo nguyên t ắc
bổ sung như vậy được gọi là quá trình lai phân tử.
2. Các phương pháp lai phân tử và ứng dụng
2.1. Phương pháp Southern blot

3


Phương pháp Southern blot cho phép nghiên cứu ADN c ủa bộ gen, ki ểm
tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong
bộ gen của tế bào.


Quy trình: - Tách ADN bộ gen của tế bào.
- Sử dụng enzyme cắt gi ới hạn đ ể cắt phân t ử ADN thành nh ững
đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách những đoạn có kích th ước khác
nhau.
- Gây biến tính ADN trên gel b ằng dung d ịch NaOH-0,5M, sau đó,
chuyển ADN từ gel sang màng lai. Trong quá trình chuy ển, v ị trí của ADN
phải được giữ nguyên.
- ADN cố đ ịnh trên màng đ ược lai v ới m ẫu dò có đánh d ấu phóng
xạ, ở nhiệt độ 65°C và thời gian lai khoảng 3- 8 giờ. Sau quá trình lai ng ười
ta rửa màng lai để loại bỏ những mẫu dò không bắt cặp chuyên bi ệt v ới
ADN cố định trên màng lai.
- Dùng kĩ thuật phóng x ạ t ự ghi đ ể đ ịnh v ị các phân t ử lai. Trong
kĩ thuật này, người ta đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng
lai. Các phân tử lai có đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và k ết qu ả
được thể hiện qua các chấm đen trên phim.
* Các ứng dụng quan trọng của Sourthern blot:
- Lập bản đồ giới hạn của một gen.
- Phát hiện các đa dạng trình tự của cùng m ột gen ở các ch ủng hay các
cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng.
- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái t ổ h ợp trên
một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn.

4


2.2. Phương pháp Northern blot
Phương pháp lai Northern blot là phương pháp lai ARN c ủa tế bào v ới
mẫu dò ADN. Về nguyên tắc giống như lai Southern blot, được tiến hành
như sau:
ARN (đã được làm biến tính) sẽ được phân tích theo kích th ước nh ờ đi ện
di trên gel agarose có chứa chất làm biến tính. Các chất làm biến tính có
tác dụng ngăn cản sự hình thành cấu trúc bậc hai của ARN sau khi đã biến
tính. Và do đó, không cản trở sự di chuyển cũng nh ư sự tách c ủa các ARN
trên gel. Sau đó, ARN được chuyển lên màng lai. Nh ững ARN c ố định trên
màng lai được đem lai với mẫu dò ADN có đánh dấu phóng xạ đ ể t ạo phân
tử lai ARN-ADN. Các phân tử lai được phát hiện nh ờ kĩ thuật phóng x ạ t ự
ghi.
* Ứng dụng:
- Phát hiện sự có mặt mARN trong các mẫu khác nhau
- Phân tích sự biểu hiện của gen giữa hai mẫu
- Phát hiện virus ARN
2.3. Lai tại chỗ
Lai tại chỗ là phương pháp lai phân t ử, trong đó, trình t ự axit nucleic c ần
tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô.
Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu axit nucleic mà không c ần qua giai đo ạn
tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Các ứng dụng của kiểu lai này r ất đa
dạng đi từ kĩ thuật định vị gen trên nhiễm sắc thể, phát hiện dòng vi
khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng đến việc nghiên c ứu m ột
mARN chuyên biệt trong tế bào và mô. Phương pháp này ít tốn kém h ơn là
lai Southern blot, mẫu dò được đánh dấu bằng huỳnh quang thay cho m ẫu
5


dò đánh dấu phóng xạ. Tùy từng loại tế bào và mô có th ể th ực hi ện các
phương pháp lai tại chỗ khác nhau.
* Ứng dụng:
- Lai trên tế bào và mô: thường được sử dụng để phát hiện các mARN.
Các loại mARN hoạt động ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát
triển tế bào và cơ thể. Lai trên tế bào và mô nhằm nghiên cứu giai đo ạn
hoạt động của mARN, từ đó, tìm hiểu hoạt động của một gen, mối liên
quan giữa phiên mã và giải mã, định vị các gen cần nghiên cứu trên nhiễm
sắc thể.
- Lai trên NST: Phương pháp này cung cấp thông tin chính xác v ề v ị trí và
sự phân bố của một trình tự ADN cần tìm trên nhiễm sắc th ể nh ờ m ột
mẫu dò chuyên biệt.
- Lai trên khuẩn lạc: Phương pháp này được s ử dụng đ ể phát hi ện dòng
vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Ngân
hàng gen được trải trên mặt thạch của hộp petri. Sau khi các khuẩn lạc
đạt kích thước nhất định, người ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp
một màng lai trên mặt thạch. Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khu ẩn
trên màng lai. Sau đó xử lí màng lai bằng NaOH để làm v ỡ tế bào vi khuẩn
và làm biến tính ADN. Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác
định dòng vi khuẩn cần tìm trên hộp pectri ban đầu. Dòng này sẽ đ ược thu
nhận và phân tích.
II. PCR
1. PCR là gì?
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, là Ph ản ứng
chuỗi trùng hợp hoặc "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thu ật
6


phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản
sao) một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật sống nh ư E. coli
hay nấm men.
Trong thực tiễn, PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã
xác định được một phần; hoặc khuếch đại 1 đoạn ADN ở 1 vùng bất kì
trong gennom khi trình tự nu ở 2 đầu đoạn ADN đó đã bi ết. Đó có th ể là
một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR
có thể copy một mảnh ADN ngắn, có thể lên đến 10kb. Một vài ph ương
pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so v ới
nhiễm sắc thể ADN trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người ch ứa
hơn 3 tỉ cặp base.
PCR cần rất nhiều thành phần, gồm: - ADN mẫu ch ứa mảnh DNA cần
khuếch đại.
- C ặp m ồi (primer), đ ể xác đ ịnh đi ểm b ắt
đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
- ADN-polymerase xúc tác cho vi ệc nhân
lên của ADN.
- Nucleotides (ví d ụ dNTP) là nguyên li ệu
cho ADN-polymerase để xây dựng ADN mới.
- Dung d ịch đ ệm, cung c ấp môi tr ường hóa
học cho ADN-polymerase.
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng
và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng.
Đoạn mồi: Là đoạn ADN cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn
lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi ADN nhân tạo – không quá 50 (th ường
18-25) nucleotides phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết
thúc của ADN cần khuếch đại. Nó gắn chặt với ADN mẫu ở nh ững đi ểm
khởi đầu và kết thúc, nơi mà ADN-polymerase nối và bắt đầu quá trình
7


tổng hợp của sợi ADN mới. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40
nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75 °C.
2. Quy trình PCR
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ g ồm 2-3 giai đo ạn
biến đổi nhiệt độ (thường là 3). Nhiệt độ và th ời gian th ực hiện c ủa mỗi
chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Những yếu tố này gồm enzyme tổng
hợp ADN, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng trong ph ản ứng, và nhi ệt đ ộ
nóng chảy (Tm) của mồi.
- Giai đoạn 1- Biến tính: Nhiệt độ tăng lên 92-96 °C đ ể tách hai s ợi ADN
ra. Trước chu kỳ 1, ADN thường được biến tính đến th ời gian m ở chuỗi đ ể
đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi
đơn.
- Giai đoạn 2- Gắn mồi: Sau khi 2 sợi ADN tách ra, nhi ệt đ ộ đ ược h ạ
thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi ADN đơn. Nhiệt độ giai đoạn này
phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (4555 °C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến vi ệc đo ạn m ồi
không gắn hoàn toàn vào ADN mẫu, hay gắn một cách tùy tiện.
- Giai đoạn 3- Kéo dài: Hỗn hợp ADN và m ồi đ ược ủ v ới enzim Taq
polymerase và 4 loại dNTP. Enzim bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo
sợi ADN. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc ADN-polymerase. Thời gian của b ước
này phụ thuộc vào cả ADN-polymerase và chiều dài mạch ADN cần khuếch
đại.

8


Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích th ước của chúng qua
việc sử dụng điện di trên gel agarose. Kết quả là các đoạn ADN nhỏ h ơn sẽ
di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ cực âm đến c ực d ương. Kích
thước của sản phẩm PCR có thể được xác định bằng việc so sánh v ới
thang ADN, thang này có chứa các ADN đã biết trước kích th ước, cũng n ằm
trong gel.
3. Tối ưu hoá PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh nhiễm các DNA khác có trong phòng thí
nghiệm (vi khuẩn, virus, ADN,...). Vì vậy các mẫu ADN, h ỗn h ợp ph ản ứng
và quy trình ADN, phản ứng phân tích sản phẩm, nên đ ược th ực hiện trong
một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn h ợp phản ứng, ph ải
chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi
bước PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc th ử dùng trong PCR ph ải
được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các m ẫu ph ải
9


được giữ riêng biệt với các mẫu ADN khác. Phản ứng có kiểm soát (ki ểm
soát bên trong), ngoại trừ ADN khuôn mẫu, phải luôn được th ực hiện, đ ể
kiểm tra sự nhiễm bẩn.
4. Những ứng dụng của PCR
– Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu
– Phát hiện đột biến
– Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử
– Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm
– Chọn giống vật nuôi, cây trồng
– Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn
– Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng ph ưng pháp di truy ền phân
tử
– Y học – Khoa học hình sự.
– Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, n ấm, virus
– Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung th ư, các bệnh di truy ền
– Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm
– Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…
4.1. Vân tay di truyền (Finger print)
Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng đ ể xác đ ịnh m ột
người bằng cách so sánh ADN của người đó với mẫu đã có, ví d ụ nh ư, m ẫu
máu thu được từ hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền v ới mẫu
máu của người tình nghi. Có thể chỉ cần một lượng nhỏ ADN thu từ máu,
tinh dịch, nước bọt, tóc... Về lý thuyết thì chỉ cần m ột mạch ADN đ ơn là đ ủ.
ADN của tất cả mọi sinh vật đều cơ bản giống nhau. S ự khác nhau duy
nhất giữa các cá thể trong cùng một loài là trình tự các cặp base. Có hàng t ỉ
cặp base trong ADN của mỗi cá nhân, do đó trình tự base ở mọi người là
khác nhau.
10


Mọi cá thể có thể được nhận dạng dựa trên trình tự các c ặp base c ủa
họ. Tuy nhiên, do có hàng tỷ cặp base nên công việc sẽ vô cùng khó khăn.
Thay vào đó các nhà khoa học có thể sử dụng một phương pháp ngắn h ơn,
đơn giản hơn nhiều dựa vào các trình tự lặp lại trong ADN. Trong kỹ thu ật
nhận diện ADN, độ dài của nhiều đoạn ADN lặp lại, nh ư các đoạn trình t ự
vi vệ tinh (microsatellite) và vệ tinh nhỏ (minisatellite), được so sánh giữa
các cá nhân có liên quan.
Các trình tự lặp lại không biểu diễn “dấu vân tay” của m ột cá th ể nh ưng
chúng có thể khẳng định được rằng liệu hai mẫu ADN là từ một ng ười, t ừ
hai người có liên quan huyết thống hay từ hai người không có quan h ệ gì.
Các nhà khoa học sử dụng một số lượng nhỏ các trình tự ADN có s ự biến
đổi giữa các cá thể để phân tích những khả năng liên hệ có th ể có.
4.2. Kiểm tra huyết thống
Mặc dù các "dấu vân tay" là duy nhất (tr ừ cặp song sinh gi ống h ệt
nhau), mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ và con hoặc anh ch ị em ruột,
có thể được xác định từ hai hoặc nhiều dấu vân tay di truy ền, có th ể đ ược
sử dụng để thử nghiệm quan hệ cha con. Một biến thể của kỹ thuật này
cũng có thể được sử dụng để xác định các mối quan hệ tiến hóa gi ữa các
sinh vật.
4.3. Chẩn đoán bệnh di truyền
Phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình
lâu dài và khó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử d ụng
phương pháp PCR. Mỗi gen trong câu hỏi có th ể dễ dàng đ ược khuếch đ ại
qua PCR bằng cách sử dụng các loại sơn lót thích h ợp và sau đó trình t ự đ ể
phát hiện đột biến.
Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng ph ương pháp PCR thông
qua khuếch đại của ADN của virus. Phân tích này là có th ể ngay sau khi
nhiễm trùng, có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu ch ứng
11


thực tế xảy ra. Chẩn đoán sớm như vậy cho các bác sĩ dẫn quan tr ọng
trong điều trị.
4.4. Tách dòng gene
PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có th ể đ ược
chèn vào một vector. ADN sau đó có thể được chuyển vào m ột sinh v ật
khác, nơi gen và sản phẩm của nó có thể được nghiên cứu hoặc đ ể s ản
xuất hàng loạt protein hữu ích nào đó.
Cần lưu ý là, khác với PCR thông th ường (tạo dòng gen ch ưa bi ết c ấu
trúc), ở đây thường cô lập gen số lượng lớn ở dạng tinh khiết để nghiên
cứu cấu trúc trước khi tiến hành PCR.
4.5. Gây đột biến định hướng
Được áp dụng để xây dựng phân tử ADN tái tổ h ợp, đ ưa vào ho ặc b ỏ đi
hoặc thay thế các nucleotit trong 1 đoạn ADN. Các nucleotit cần gây đ ột
biến được thiết kế nằm trong trình tự của mồi.
4.6. Phân tích mẫu ADN cổ
Sử dụng PCR, nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm
tuổi. Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, ch ẳng h ạn
như một voi ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi, và cũng trên ADN của con
người, trong các ứng dụng khác nhau, từ việc phân tích các xác ướp Ai C ập
đến việc xác định một Sa hoàng Nga.
III. SẢN XUẤT VACXIN TÁI TỔ HỢP
Những vacxin kinh điển được sản xuất dựa trên vi khuẩn, virut đã b ị
làm chết hoặc độc lực của chúng đã bị suy giảm để không còn kh ả năng
gây bệnh. Tuy nhiên, những loại vacxin kinh điển này vẫn còn 1 s ố ít tác
hại không mong muốn cho người sử dụng. Vì vậy, vacxin th ế hệ m ới s ử
dụng công nghệ ADN tái tổ hợp có hoạt tính, tính đặc hiệu cao và đảm b ảo
an toàn hơn.

12


Quy trình: Gắn gen mã cho kháng nguyên của vi khu ẩn ho ặc virut gây
bệnh vào vector biểu hiện có promoter mạnh rồi đưa vào tế bào nhận.
Thu nhận và tinh sạch kháng nguyên từ những tế bào nhận này để sản
xuất vacxin.
Hoặc: Gây đột biến hoặc loại bỏ các gen quy đ ịnh độc tính c ủa ch ủng vi
khuẩn hoặc virut gây bệnh làm chúng mất khả năng gây bệnh. Sau đó s ử
dụng chúng để sản xuất vacxin.
Phân loại
Căn cứ vào nguồn kháng nguyên nhân lên được hay không nhân lên
trong cơ thể động vật, người ta chia làm 2 nhóm:
Nhóm 1: Vacxin có kháng nguyên sống được nhân lên, gồm:
- Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền
- Vacxin axit nucleic (vacxin ADN)
- Vacxin xóa gen độc
Nhóm 2: Vacxin có kháng nguyên không nhân lên, gồm: Vacxin ch ứa kháng
nguyên là protein sản xuất bằng kĩ thuật gen
* Vai trò của công nghệ ADN tái tổ hợp trong nhận dạng và sản xuất
vacxin:
1. Nhận dạng và tạo dòng các kháng nguyên có ti ềm năng vacxin
Nhiều tác nhân gây bệnh gần như không có khả năng nuôi cấy bên ngoài
vật chủ tự nhiên của chúng và điều này đã gây cản tr ở cho các cách tiếp
cận truyền thống để phát triển liệu pháp vacxin. Ví dụ: virus viêm gan B
(HBV), tác nhân gây bệnh giang mai ở người (Treponema pallidum) và vi
khuẩn gây bệnh phong (Mycobacterium leprae) không thể sinh trưởng
13


trong điều kiện in vitro. Bởi vậy, người ta không thể tạo ra các vaccine
sống nhược độc hoặc các vacxin bất hoạt bằng cách nuôi cấy các tác nhân
này. Công nghệ ADN tái tổ hợp cho phép chuy ển thông tin di truy ền t ừ
những sinh vật này vào những vật chủ “dễ nuôi” hơn như là E. coli, nấm
men hoặc tế bào động vật có vú.
Không phải tất cả các gen kháng nguyên đều dễ nhận dạng, t ạo dòng và
biểu hiện như gen kháng nguyên bề mặt của viêm gan. Trình tự nguyên
vẹn của genome HBV có kích thước nhỏ hơn 10 kb. Bởi vậy, t ương đ ối đ ơn
giản khi thiết lập khung đọc mở để biểu hiện. Tuy nhiên, ở tr ường h ợp
bệnh sốt rét thì lại khác. Genome của ký sinh trùng sốt rét lớn h ơn genome
của HBV hàng ngàn lần, vì thế người ta đã gặp rất nhiều khó khăn trong
việc thu thập các thông tin về trình tự gen thích hợp và s ản ph ẩm c ủa nó
để tạo ra bảo vệ miễn dịch, nên người ta cần phải ứng dụng công ngh ệ
ADN tái tổ hợp để sản xuất vacxin. Điểm khởi đầu của công ngh ệ ADN tái
tổ hợp là xây dựng thư viện ADN của cơ thể được nghiên cứu trong E. coli.
Thư viện cADN hoặc genomic ADN có thể cung cấp các ph ương th ức c ơ
bản để nhận dạng và phân lập các gen quan tâm.
2. Sản xuất vacxin
Quy trình sản xuất vacxin bằng công nghệ ADN tái tổ h ợp:
- Lựa chọn kháng nguyên đích.
- Phân tích và xác định gen đích.
- Nhân dòng gen.
- Biểu hiện gen trong tế bào chủ.
- Nuôi cấy và thu nhận protein.
- Kiểm tra chất lượng và tinh sạch protein.
14


- Sản xuất chế phẩm.
- Kiểm tra sản phẩm.
* Ưu diểm của vacxin tái tổ hợp:
- Năng suất cao.
- An toàn vì không sử dụng trực tiếp virut gây bệnh.
- Giá thành hạ vì không phải nuôi virut.
* Các vacxin sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp:
- Vacxin chứa kháng nguyên sản xuất bằng ADN tái tổ h ợp.
- Vacxin vectơ.
- Vacxin ADN.
- Vacxin dựa trên cơ thể chuyển gen. (VD: vacxin thực phẩm)
* Vacxin ADN:
Một hướng trong sản xuất vacxin ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp là
các vacxin ADN (miễn dịch di truyền). Các plasmid mang các gen đ ặc hi ệu
cho một hoặc nhiều protein kháng nguyên có thể được dùng để tạo miễn
dịch (chủng ngừa). Các plasmid đó được tiêm (thường vào cơ) đưa gen tr ực
tiếp vào trong một số tế bào và được hấp thu bởi các tế bào lân cận n ơi
kim tiêm được đưa vào. Ngoài ra, plasmid cũng có thể được đ ưa vào bằng
súng bắn gen (các viên đạn vàng được bọc ADN của plasmid) bằng cách
đẩy các plasmid vào trong các tế bào gần bề mặt cơ thể, th ường là da hoặc
màng nhầy. Khi vào bên trong tế bào, một vài plasmid tái tổ h ợp sẽ đi vào
nhân và do gen được điều hòa bởi một promoter mạnh của eukaryote, các
tế bào sẽ tổng hợp các kháng nguyên được mã hóa bởi plasmid.
15


IV. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
1. Sản xuất kháng sinh
Nguồn kháng sinh tự nhiên chủ yếu được tìm thấy ở vi sinh v ật. Quá
trình chọn lọc môi trường nuôi cấy cũng như sàng lọc các chủng vi sinh
vật cho kháng sinh đặc hiệu và có năng suất cao rất tốn công sức và kinh
phí. Kĩ thuật tách dòng ADN cho phép tạo ra toàn bộ các dòng g ồm nh ững
gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh. Nh ờ vậy, có th ể ki ểm soát
và điều chỉnh một cách chủ động toàn bộ quy trình sản xuất kháng sinh ở
quy mô công nghiệp.
2. Sản xuất hoocmon
Kĩ thuật gen đã phân lập cADN của những gen mã cho các hoocmon đó
và đưa chúng vào vector có promoter mạnh. Vector tái tổ hợp được biến
nạp vào tế bào nhận; từ đó các protein tương ứng được tách chi ết và tinh
sạch.
2.1. Hormone sinh trưởng người (human growth hormone-HGH)
Hormone sinh trưởng người là protein chứa khoảng 191 axit amin, thiếu
nó cơ thể người sẽ bị lùn. Trước đây hormone phát triển được tách t ừ
tuyến yên của người chết. Mỗi tử thi cho khoảng 4-6 mg HGH và mu ốn
chữa khỏi cho một người lùn phải cần lượng HGH thu được từ 100-150 t ử
thi. Điều này cho thấy một trở ngại rất lớn khi chữa trị ch ứng lùn cho tr ẻ
em. Bằng công nghệ ADN tái tổ hợp, người ta có th ể thu nh ận một l ượng
lớn HGH từ vi khuẩn E. coli đã tái tổ hợp (1 lít dịch lên men của E. coli thu
được một lượng HGH tương đương với lượng thu được từ 60 t ử thi).
Hormone sinh trưởng người tái tổ hợp khác với hormone sinh trưởng
người bình thường một axit amin đó là do E. Coli không có khả năng loại
bỏ gốc methionine khởi đầu, thông thường amino acid này ch ỉ bị loại sau
16


khi dịch mã trong tế bào người. Hormone sinh trưởng người là một trong
những protein được sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp sớm nh ất.
2.2. Somatostatin
Somatostatin là loại hormone đặc biệt, thường được tổng h ợp trong
não động vật và người với một hàm lượng vô cùng thấp. Somatostatin có
vai trò điều hòa hormone sinh trưởng và insulin đi vào máu, kiểm tra s ự
tổng hợp hai loại hormone này.
Quy trình sản xuất loại sản phẩm sinh h ọc đặc biệt quý này cũng bao
gồm các bước chủ yếu sau đây:
- Phân lập gen mã hóa somatostatin hoặc tổng h ợp trong ống nghi ệm.
- Tạo dòng gen somatostain bằng cách gắn gen này vào plasmid vector
để chuyển gen vào E. coli.
Mỗi mẻ 7,5 l vi khuẩn E. coli nuôi cấy sẽ cho ra 5 mg somatostatin
nguyên chất. Khối lượng hormone này trước đây muốn có ph ải tiến hành
cả năm trên nguyên liệu lấy từ nửa triệu não cừu.
3. Sản xuất kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb ) là kháng th ể đ ược
tạo thành từ những tế bào lympho B có nguồn gốc từ một dòng tế bào
lympho B.
Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một kháng
nguyên cho sẵn. Theo định nghĩa, tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một
dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng t ương bào.

17


Kháng thể đơn dòng chỉ liên kết với

Kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể

1 epitop đặc hiệu

liên kết với 1 epitop khác nhau

Kháng thể đơn dòng có rất nhiều ứng dụng trong chẩn đoán và đi ều tr ị
bệnh, đặc biệt là điều trị ung thư. Có thể phân biệt tế bào ung th ư v ới tế
bào lành nhờ kháng nguyên trên bề mặt tế bào ung th ư. Kháng thể đơn
dòng đặc hiệu với kháng nguyên được sản xuất nhờ công nghệ ADN tái tổ
hợp. Kháng thể này được ghép nối với độc tố hoặc với đồng v ị phóng x ạ
rồi đưa vào cơ thể. Nhờ kháng thể chỉ liên kết đặc hiệu với kháng nguyên
trên bề mặt tế bào ung thư nên chỉ những tế bào này bị tiêu diệt.
3.1. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ ADN tái tổ hợp biểu hiện
trên Phage
* Cơ chế:
Được đề ra bởi George P. Smith vào giữa thập niên 1980, đoạn gen mã
hóa cho một protein ngoại lai được chèn vào th ực khuẩn th ể
(bacteriophage) M13, hoặc virus để thâm nhập vào tế bào E.coli. Trong tế
bào E.coli, protein ngoại lai sẽ được biểu hiện lên trên bề mặt phage, tạo
điều kiện cho việc sàng lọc. Phương pháp sàng lọc dựa trên m ối liên h ệ
được thiết kế giữa gen mã hóa và protein biểu hiện. Năm 1990, McCafferty
và cộng sự đã chứng minh kỹ thuật này có thể áp dụng để biểu hiện các
18


đoạn kháng thể trên bề mặt phage. Từ đó, khái niệm “thư viện kháng th ể”
được ra đời.
* Thư viện kháng thể:
Các gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng th ể đ ược khuếch
đại trong tế bào sản xuất kháng thể, hoặc trong phòng thí nghiệm. Sau đó,
chúng được kết hợp với nhau và tạo dòng trong các phage đặc biệt. Vì các
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kết hợp ngẫu nhiên, nên mỗi phage chỉ có kh ả
năng biểu hiện một kháng thể duy nhất với vùng gắn đặc hiệu cho m ột
loại kháng nguyên. Kết quả là một “thư viện kháng thể” được tạo thành.
* Chọn lọc kháng thể:
Quy tắc của quá trình chọn lọc kháng th ể là d ựa vào vi ệc g ắn đ ặc hi ệu
của kháng thể với kháng nguyên tương ứng. Và một trong những phương
pháp chọn lọc đơn giản nhất chính là ELISA. Thư viện kháng th ể sẽ đ ược ủ
với kháng nguyên đích cố định sẵn trong các giếng ELISA. Nh ững phage
mang kháng thể mong muốn gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích sẽ đ ược
giữ lại, trong khi các phage khác sẽ bị loại bỏ qua giai đoạn r ửa trôi. Tiếp
theo, các phage kháng thể mong muốn được tách khỏi kháng nguyên, và
thâm nhập vào tế bào E.coli để nhân dòng. Quá trình này đ ược lặp l ại 3 – 4
lần. Cuối cùng, quá trình sẽ kết thúc bằng việc tăng độ chọn lọc của b ước
rửa và/hoặc giảm nồng độ kháng nguyên ở mỗi vòng, và bạn sẽ thu hoạch
được các phage mang kháng thể mong muốn với ái lực và tính ổn đ ịnh cao.
Các gen mã hóa cho kháng thể mong muốn sẽ được giải trình tự, và tối ưu
hóa ái lực (nếu cần thiết). Những gen nào cho kháng th ể tốt nhất sẽ đ ược
chuyển vào hệ thống biểu hiện thích hợp để tiến hành sản xuất kh ối
lượng lớn hơn.
3.2. Kháng thể đơn dòng trong nghiên cứu Sinh-Y
19


Các kháng thể đơn dòng là những tác nhân ph ản ứng c ần thi ết đ ể phân
lập, nhận diện và xác định vị trí của các sản phẩm đặc trưng c ủa gen trong
tế bào và để trợ giúp trong việc xác định cấu trúc đại phân t ử c ủa chúng.
- Các kháng thể đơn dòng dựa theo các chỉ th ị tế bào ch ất và b ề m ặt tế
bào có một ảnh hưởng không chỉ trong nghiên cứu cơ bản mà còn cho
phép phát triển các phương thức trong điều trị. Chẳng hạn, sự biểu hiện
dư thừa của thụ thể đối với nhân tố sinh trưởng biểu mô (EGF) và các th ụ
thể liên quan, một sản phẩm của proto-oncogene c-erbB-1, được tìm th ấy
là chỉ thị của sự tiên lượng trong các bệnh nhân mang ung th ư biểu mô tế
bào vảy hoặc u tuyến. Cũng như vậy, nhiều chất chỉ thị bề mặt của tế bào
được phát hiện trên leukocyte được sử dụng để nhận dạng các u ác tính và
quyết định phương pháp điều trị.
- Phân tích miễn dịch bằng phương pháp RIA và ELISA, d ựa trên nguyên
tắc dùng kháng thể đơn dòng để phát hiện kháng nguyên t ương ứng của
nó trong các mẫu phân tích nhờ phản ứng gắn rất đặc hiệu của kháng th ể
đơn dòng với kháng nguyên.
- Ức chế thải loại khi ghép cơ quan bằng cách s ử d ụng kháng th ể đ ơn
dòng chống kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T, nh ằm loại bỏ
phản ứng thải loại khi ghép các cơ quan của người với nhau.
- Chẩn đoán hình thành khối u, khi có s ự hình thành kh ối u trong máu sẽ
xuất hiện một số tác nhân đánh dấu. Do đó, có thể sử dụng các ph ương
pháp phân tích miễn dịch để phát hiện các tác nhân trên trong máu ho ặc
trên khối u.
- Định hướng thuốc chữa bệnh, lợi dụng khả năng các phân t ử kháng
thể gắn rất đặc hiệu với tế bào ở vị trí xác định nào đó của c ơ th ể (trong
đó có tế bào ung thư) để định hướng thuốc chữa bệnh hoặc độc chất t ới
20


trực tiếp khối u hoặc nơi cần chữa trị như vậy sẽ tăng hiệu quả ch ữa tr ị
lên nhiều lần.
3.3. Kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán và điều tr ị bệnh
- Kháng thể đơn dòng có công dụng đặc biệt quan tr ọng, đ ược s ử d ụng
để chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền, dị ứng, rối loạn mi ễn
dịch.
- Dùng kháng thể đơn dòng là ph ương tiện rất nh ạy và đ ơn gi ản đ ể
chẩn đoán có thai, các bệnh lao, phong...
- Kháng thể đơn dòng còn được dùng để chẩn đoán di căn ung th ư n ếu
có gắn thêm đồng vị phóng xạ.
Phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng đã nhanh chóng thay th ế các
phương pháp miễn dịch học và huyết thanh học truyền thống trong các xét
nghiệm như:
- Xác định lượng hormone để đánh giá ch ức năng nội tiết.
- Phát hiện một số protein có ý nghĩa để ch ẩn đoán kh ối u.
- Xác định vi khuẩn và virus gây bệnh.
- Phát hiện trong máu các cầu thủ, các chất kích thích bị cấm s ử d ụng,
kiểm tra nồng độ thuốc trong máu và các tổ chức cơ thể nhằm bảo đ ảm
liều thuốc dùng không quá ngưỡng gây độc.
- Kháng thể đơn dòng còn được dùng để ức chế ph ản ứng đào th ải khi
cấy ghép cơ quan (ghép thận, truyền tủy...).
4. Sản xuất insulin

21


Insulin là protein chứa 51 axit amin đ ược t ổng h ợp ở tuy ến t ụy c ủa
người. Vào đầu những năm 80 hãng Eli Lilly và Gentech Inc. (Mỹ) đã đ ưa ra
quy trình sản xuất insulin người bằng công nghệ ADN tái tổ h ợp. Đó là
protein đầu tiên tạo được bằng công nghệ gen và nhờ công nghệ này mà
hiện nay insulin đã được sản xuất đại trà với giá thành r ẻ h ơn nhiều so
với trước kia.
Công nghệ sinh học hiện đại đã sản xuất insulin trong vi khu ẩn E. coli
bằng cách:
- Tách gen phụ trách tổng hợp insulin trong c ơ th ể s ống, có th ể t ừ
người hoặc từ chuột. Gen insulin cũng có thể được tổng h ợp nhân t ạo
trong ống nghiệm.
- Tạo dòng gen insulin bằng cách gắn gen insulin vào plasmid vector sau
đó chuyển plasmid này vào tế bào vi khuẩn nhận (E. coli) để sản xuất một
lượng sinh khối lớn phục vụ cho việc tách chiết insulin.
5. Sản xuất interferon
Interferon là nhóm protein chứa khoảng 146-166 amino acid, chúng
xuất hiện trong tế bào động vật có xương sống khi bị nhiễm virus và giúp
tế bào kháng lại virus. Cho đến thời gian gần đây, interferon ch ủ y ếu v ẫn
được sản xuất từ tế bào bạch cầu hay nguyên bào bạch huy ết của người bị
nhiễm virus. Tuy nhiên, bắt đầu từ năm 1980 người ta đã phân l ập đ ược
các gen mã hóa tổng hợp ba loại interferon trên và xây d ựng đ ược công
nghệ sản xuất interferon từ tế bào E. coli và nấm men. Interferon là loại
protein tương đối đơn giản, chịu được nhiệt độ tới 65 0 C, là sản phẩm của
tế bào sống, nên bản thân nó không độc.
Chương trình sinh tổng hợp tự nhiên interferon đ ược mã hóa trong gen,
nhưng sự tổng hợp này chỉ xảy ra khi có virus xâm nh ập c ơ th ể. Các thành
22


tựu của công nghệ sinh học hiện đại đã mở ra một cuộc cách mạng trong
nghiên cứu cấu trúc và hoạt động của interferon. Có ba loại interferon là α,
β và γ khác nhau bởi số amino acid và hoạt tính: - α-interferon do bạch
cầu sản xuất khi có virus xâm nhập.
- β-interferon do nguyên bào s ợi s ản xu ất khi có
virus xâm nhập.
- γ-interferon do b ạch c ầu s ản xu ất qua ph ản
ứng của hệ miễn dịch.
Về cơ chế, interferon không tác động trực tiếp lên virus, mà tác đ ộng
lên tế bào, để các tế bào này tổng hợp ra loại protein đặc biệt, có kh ả năng
kìm hãm sự phát triển của virus xâm nhập cơ thể. Hiện nay, người ta đã
phát hiện được năm loại protein này. Khi virus xâm nhập ồ ạt vào cơ th ể,
như khi có nạn dịch virus, thì interferon tự nhiên không đủ đ ể chống l ại
virus.
Trước đây, người ta phải dùng máu để tách interferon t ừ b ạch c ầu dùng
trong điều trị viêm gan do virus, nhưng rất đắt. Nếu tách t ừ máu ra đ ể lấy
interferon, thì dù có tách từ máu toàn bộ loài người cũng không đ ủ để ch ữa
bệnh cho một người. Bằng công nghệ sinh học hiện đại, người ta đã tách
gen interferon từ cơ thể sống, tạo dòng trong plasmid vector và chuy ển
gen này vào vi khuẩn E. coli, để vi khuẩn này sản xu ất interferon v ới hi ệu
suất lớn, do đó thành tựu nói trên đã trở thành cuộc cách mạng v ề
interferon.
6. Sản xuất interleukin
Tương tự interferon, một sản phẩm khác cũng giúp c ơ th ể tăng kh ả
năng miễn dịch là interleukin cũng đã được sản xuất theo công ngh ệ ADN
tái tổ hợp. Interleukin là một lymphokine bao gồm interleukin-1 (IL-1) và
23


interleukin-2 (IL-2), có khả năng điều hòa miễn dịch và ch ống ung th ư.
Hiện nay, interleukin và interferon đang được th ử nghiệm cùng v ới một s ố
biệt dược khác để chữa trị bệnh ung thư và bệnh AIDS. Interleukin-2 (IL2) là một cytokine quan trọng nhất đối với sự phát triển và đáp ứng miễn
dịch thích ứng. IL-2 có vai trò chính trong hoạt hóa các lympho T, ví d ụ các
tế bào ác tính lympho T đã bộc lộ quá mức các th ụ th ể IL-2, nên có th ể
nghĩ rằng IL-2 là yếu tố sinh trưởng của tế bào. Ngược lại, việc s ử dụng
tăng cường chức năng của IL-2, cũng làm tăng đáp ứng miễn dịch chống l ại
các khối u. Liệu pháp tiêm trực tiếp IL-2 vào mạch máu cũng làm tăng
lượng tế bào lympho, làm tăng tế bào NK và làm tăng hoạt động của các
dạng tế bào kiểu LAK. Liệu pháp này đang được sử dụng cho m ột số bệnh
ung thư, như ung thư da ác tính (melanoma) và ung thư biểu mô thận .
V. LIỆU PHÁP GEN
Đối với loại bệnh di truyền, bệnh do đột biến gen người ta ph ải c ần
đến sự can thiệp của liệu pháp gen, một hướng ch ữa bệnh gắn liền v ới
các kỹ thuật tiên tiến trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đ ại nh ư các
vi thao tác gen, sửa đổi thay thế gen...
Liệu pháp gen thực chất là phương pháp ch ữa bệnh bằng gen.
Trong đó, gen trị liệu có thể là: - Các gen hoạt động bình th ường (gen lành)
có thể đưa vào tế bào để thay thế gen hỏng, gen mất chức năng, khôi ph ục
hoạt động bình thường của tế bào và sự sống của cơ thể.
- Là nh ững gen có kh ả năng mã hóa m ột protein
đặc hiệu khi đưa vào tế bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hi ệu.
Các protein đặc hiệu có thể ức chế hoạt động của một gen khác trong t ế
bào, kìm hãm khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào b ị
bệnh.
24


- Nh ững gen khi đ ưa vào t ế bào ho ạt đ ộng đ ồng
thời với các gen bệnh (gen bị đột biến trong tế bào) làm hạn chế tác động
của gen bệnh hoặc hỗ trợ, bù đắp cho các gen bị hỏng.
- Gen li ệu pháp còn là các gen b ất ho ạt đ ược đ ưa
vào tế bào thay thế cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản ph ẩm
không cần thiết của gen lành hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái m ới, có
tác dụng chống lại bệnh tật.
- Gen tr ị li ệu có th ể là nh ững đo ạn oligonucleotide
có tác dụng kìm hãm hoạt động của gen bị hỏng, bị đột biến trong tế bào.
1. Các loại liệu pháp gen
Liệu pháp gen được chia làm hai nhóm ph ương pháp c ơ bản là li ệu
pháp gen soma và liệu pháp gen giao tử (còn gọi là liệu pháp t ế bào m ầm).
1.1. Liệu pháp soma
Là phương pháp điều trị thay thế hoặc sữa chửa gen hỏng, gen bệnh
của các tế bào soma trong cơ thể người bệnh, giúp người bệnh có th ể có
cuộc sống bình thường.
Liệu pháp gen soma có thể sử dụng một số loại tế bào nh ư: tế bào
lympho, nguyên bào sợi, tế bào gốc, tế bào gan, tế bào biểu bì...
Liệu pháp gen soma đến nay đã chữa và điều trị khỏi hoặc h ạn ch ế
biểu hiện cho một số khá lớn người bệnh mang các bệnh hiểm nghèo nh ư:
thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng (SCID), ung th ư, thiếu máu h ồng
cầu liềm, xơ nang...
1.2. Liệu pháp gen tế bào mầm

25


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×