Tải bản đầy đủ

CHUYÊN đề kỹ THUẬT tạo DÒNG

CHUYÊN ĐỀ KỸ THUẬT TẠO DÒNG
PHẦN A. NỘI DUNG CHUYÊN ĐỀ
I. Quy trình chung của kỹ thuật tạo dòng
II. Tạo vector tái tổ hợp
1. Chọn và chuẩn bị vector
2. Chuẩn bị trình tự ADN cần tạo dòng
3. Chọn tế bào chủ phù hợp
4. Tạo vector tái tổ hợp
III. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nhận.
IV. Chọn lọc dòng tế bào nhận có chứa ADN tái tổ hợp.
V. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào nhận

PHẦN B. MỘT SỐ CÂU HỎI ÔN TẬP
Các từ viết tắc:
- Linker: Đoạn nối
- Insert: Trình tự ADN cần tạo dòng
- RE: Enzim cắt giới hạn

PHẦN A. NỘI DUNG CHUYÊN ĐỀ
I. Quy trình chung của kỹ thuật tạo dòng.


1


Kỹ thuật tạo dòng có thể chia thành các bước khác nhau, tuy nhiên tựu trưng lại có thể
chia thành 3 bước cơ bản:
Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp (ADN tái tổ hợp)
Bước 2: Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào nhận
Bước 3: Chọc lọc dòng tế bào nhận có vector tái tổ hợp
Quy trình tạo dòng có thể được mô tả qua hình ảnh minh họa sau:
ADN ngoại lai có
gen cần chuyển

Gen kháng kháng sinh

vị trí cắt của enzim cắt

Đầu
dính

Plasmid không phù hợp
ADN không phù hợp

ADN tái tổ
hợp mong muốn

NST vi khuẩn

ADN tái tổ
hợp mong muốn

Trong 3 bước nêu trên, bước đầu tiên có ý nghĩa tiên quyết. Để thành công ở bước này
– tức là tạo ra được vector tái tổ hợp, phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau. Ngày nay, với
sự ra đời của các kỹ thuật di truyền, đã góp phần giải quyết những khó khăn của việc tạo
vector tái tổ hợp, một trong những sự hỗ trợ đó là việc chọn lọc gen cần chuyển không còn
phức tạp như trước kia nữa.

2


Về cơ bản, kỹ thuật tạo dòng nhằm mục đích nghiên cứu và ứng dụng gen cũng như


các sản phẩm do gen tạo ra.
II. Tạo vector tái tổ hợp.
Bước này rất quan trọng, để tạo thành công viector tái tổ hợp cần phải chọn và chuẩn
bị vector, chuẩn bị gen cần tạo dòng, cắt lấy gen và gắn vào vector để tạo vector tái tổ hợp.
1. Chọn và chuẩn bị vector:
Vector là một trình tự ADN ngắn có nguồn gốc virut, vi khuẩn, hay tế bào nhân thực,
có thể tồn tại ổn định trong tế bào chủ và mang được một trình tự ADN có nguồn gốc khác
(ADN ngoại lai) cần tạo dòng – gen cần chuyển.
Một vector có những thành phần cơ bản sau:
- Trình tự khởi đầu sao chép (ori): Đặc trưng cho tế bào chủ, cho phép vector nhân bản
độc lập trong tế bào chủ.
- Gen chọn lọc: Cho phép nhân biết tế bào chủ có chứa vector, thường là gen
khángkháng sinh, đặc trưng cho tế bào chủ.
- Các trình tự nhận biết duy nhất của enzyme giới hạn: Cho phép gắn chèn trình tự cần
tạo dòng vào vector.
Ngoài ra có thể có thêm một số trình tự khác như gen reporter để nhận biết vector tái
tổ hợp, promoter để biểu hiện gen tạo dòng, …
Một số loại vector thường dùng trong kỹ thuật tạo dòng hiện nay:
(1) Plasmid: Đây là một ADN dạng vòng, là loại vector phổ biến nhất, có khả năng
mang trình tự nucleotit cần tạo dòng khoảng 10 kb, thường tạo nhiều bản sao (ví dụ pUC19
500 – 700 bản sao trên tế bào)
Một số plasmid phổ biến:

pUC19 có trình tự ori, phù hợp tế bào chủ E. coli với 2 gen chọn lọc: kháng ampicillin
và biến dưỡng (lacZ). Plasmid này có các trình tự nhận biết RE tập trung vào vùng polylinker
(MCS).

3


pBR322 có trình tự ori, phù hợp tế bào chủ E. coli với 2 gen chọn lọc: kháng
ampicillin và tetracyclin. Các trình tự nhận biết RE phân bố khắp plasmid.

pGEM-T Easy có trình tự ori, phù hợp tế bào chủ E. coli và trình tự f1 ori tử phage f1,
với 2 gen chọn lọc là: gen kháng ampicillin và lacZ. Các trình tự nhận biết RE tập trung vào
vùng MCS. Plasmid này có mang promoter T7 và SP6.
(2) Bacteriophage (phage):Phổ biến nhất là phage lambđa và M13, có thể mang
khoảng 10-15 kb,tối đa là 45-50 kb. Hiệu quả lắp ADN tái tổ hợp vào đầu phage và chuyển
gene vào vi khuẩn thông qua tải nạp.
Phage λ (khoảng 48kb) là ADN mạch thẳng có đuôi mạch đơn (trình tự cos) khi nằm
trong đầu phage. Khi được bơm vào vi khuẩn, phage sẽ đóng vòng do sự bắt cặp của các
trình tự cos. Enzyme terminase của phage cắt mở vòng tại trình tự cos.

4


Vector phage có 2 dạng: dạng gắn thêm (insertion) và dạng thay thế (replacement):
- Dạng gắn thêm có mang 1 vị trí gắn chèn và có thể thu nhận khoảng 5-11 kb.
- Dạng thay thế có các vị trí cắt nằm kèm 1 vùng gen không cần cho tạo dòng, sẽ bị
loại bỏ và thay bằng 1 trình tự khoảng 8-24 kb. Trình tự cần tạo dòng phải được gắn giữa
cánh trái và cánh phải của phage với 2 đầu mút là các trình tự cos.
Kích thước DNA tái tổ hợp là một yếu tố chọn lọc: quá nhỏ hay qua lớn đều có vấn đề
khi “đóng gói”.
Phage M13 (khoảng 6.4 kb) có ADN mạch đơn dạng vòng. Khi xâm nhiễm vi khuẩn
có lông gai giới tính (mang plasmid F), ADN này được chuyển thành ADN mạch đôi dạng
vòng gọi là RF (replicative form). “Thể sao chép” sao chép theo kiểu vòng xoay tạo nhiều
mạch đơn (+), lắp vào đầu tạo phần tử phage mới và được thải ra khỏi tế bào. M13 không ly
giải tế bào chủ. Các vector mp (M13mp) là ADN M13 tái tổ hợp có chứa một trình tự DNA
E. coli mã hóa 1 tiểu phần β-galactosidase và vùng điều hòa, 1 vùng polylinker với nhiều
trình tự cắt duy nhất của các RE. Vector M13 được dùng để thu nhận ADN mạch đơn cho gây
tạo đột biến điểm định hướng hay dùng trong kỹ thuật phage display.

(3) Vector “lai” giữa 2 loại trên: cosmid có thể mang khoảng 45 kb và phagemid:

Phagemid bao gồm phage và plasmid. Vector có mang trình tự ori để sao chép ADN
mạch đôi trong E. coli và trình tự f1 ori từ phage f1 để tạo ADN mạch đơn đóng gói trong
phage. Đây là dạng vector “con thoi”. Khi biến nạp phagemid vào vi khuẩn, phagemid được

5


sao chép như plasmid. Khi xâm nhiễm E.coli với pBluescript và 1 helper phage (M13K07),
ADN mạch đơn sẽ được đóng gói tạo phage.
Cosmidbao gồm plasmid và trình tự cos của phage lambđa.Có thể thu nhân 28-52 kb
(trung bình 45 kb) ADN, dùng để tạo thư viện DNA bộ gen.
Vector tái tổ hợp có thể được đóng gói trongphage và xâm nhiễm hiệu quả vi khuẩn.
Trongvi khuẩn, cosmid được đóng vòng.Các trình tự DNA cần tạo dòng phải có kíchthước
phù hợp.

Vi khuẩn mang cosmid tái tổ hợp tạo khuẩn lạcPhage chứa ADN mạch đơn cần tạo
dòng đượctiết ra môi trường.
(4) Vector virus: Baculovirus, adenovirus, retrovirus, có thể mang 8-10 kb, thường
dùng trong liệu pháp gene, tạo vaccin.
Vector virus có một số đặc điểm như:
- Có phổ tế bào chủ xác định
- Một số virus có thể gắn chèn vào nhiễm sắc thể và biểu hiện bền vững
- Hiệu quả chuyển gene cao.
Một số vector virus thông dụng:
- Retrovirus: có thể thu nhận 8-10 kb ADN, xâm nhiễm tế bào đang phân chia tích
cực, có khả năng găn chèn vào nhiễm sắc thể, có thể dẫn đến ung thư.
- Lentivirus: Là một nhóm retrovirus có khả năng xâm nhiễm và gắn chèn vào nhiễm
sắc thể tế bào không phân chia, an toàn hơn các retrovirus khác.
- Adenovirus: Không gắn chèn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ và không nhân bản khi tế
bào phân chia.
(5) Vector nhiễm sắc thể nhân tạo:
- BAC (Bacterial Artificial Chromosome): dựa trên plasmid F, có mang các gen “phân
chia” cần cho sự chia đều các bản sao plasmid về 2 tế bào con. Có thể mang 150-350 kb.
BAC Gồm các thành phần:
+ RepE:Sao chép plasmid và điều hòa số lượng bản sao
+ ParA, parB, parC: chia đều plasmid về 2 tế bào con khi phân chia, duy trì tính ổn
định của BAC
6


+Gen chỉ thị: Cmr (kháng chloramphenicol), lacZ
+ Promoter (t7, Sp6)

- YAC (Yeast Artificial Chromosome): Dựa trên DNA Saccharomyces cerevisiae gắn
với 1 plasmid. YAC Có thể mang 100 – 1000 kb. Gồm các thành phần:
+ TEL:Telomere bảo vệ đầu mút nhiễm sắc thể
+ CEN:Centromere ổn định sự phân chia nhiễm sắc thể
+ ARS (Autonomously Replicating Sequence):Vị trí khởi đầu sao chép
+ Gen chỉ thị: HIS3, URA3, TRP1, ampR
+ Trình tự nhận biết của BamHI và EcoRI

- HAC (Human Artificial Chromosome): Vi nhiễm sắc thể (6-10 Mb thay vì 50-250
Mb), hoạt động như một NST mới trong tế bào người. HAC gồm các thành phần chính:
+ Vị trí khởi đầu sao chép
+ Centromere đảm bảo sự phân chia các NST khi phân bào
+ Telomere bảo vệ đầu mút NST
Có hai cách tạo HAC:
+ Loại bỏ dần các trình tự trên NST tự nhiên, chỉ giữ lại các trình tự thiết yếu
+ “Lắp ráp” mới (de novo) từ các trình tự DNA vệ tinh alphoid I
HAC có ưu điểm so với BAC và YAC: Không gắn chèn vào NST và có khả năng
mang vô hạn
2. Chuẩn bị trình tự ADN cần tạo dòng:
- Dùng RE cắt ADN NST của tế bào cho để lấy đoạn nucleotit cần tạo dòng. RE dùng
để cắt trong trường hợp này phải cùng loại với RE cắt vector.
7


- Có một số cách cắt của RE:
+ Cắt đầu bằng: ví dụ RE Smal

+ Cắt đầu so le kiểu “5 – overhang”: Ví dụ RE BamHI

+ Cắt so le kiểu “3 – overhang”: Ví dụ RE PstI

- Nhân bản trình tự cần tạo dòng bằng PCR với primer được thiết kế gồm vùng đặc
hiệu cho gen và vùng mang trình tự nhận biết của RE:

8


Gắn mồi oligo T

Phiên mã ARN thành ADN

Cắt bỏ ARN
ADN sợi đơn
Gắn mồi oligo C

Tổng hợp sợi bổ sung

Metyl hóa ADN
ADN sợi kép
Trật tự cắt EcoRI
Nối linker vào ADN

Cắt linker bằng EcoRI

Đầu dính

Nối ADN vào vector
và lây nhiễm vào E.coli

Dòng ADN nhân bản

3. Chọn tế bào chủ phù hợp:
- Những đặc tính mong muốn của tế bào chủ dùng trong tạo dòng: Có thể tiếp nhận
vector, có đặc tính để nhân biết tình trạng có hay không có mang vector hay vector tái tổ hợp,
có thể nhân bản tạo số lượng lớn gen cần tạo dòng, không thủy phân phân giải hay biến đổi
gen cần tạo dòng.
9


- Với những đặc tính trên, E. coli là tế bào chủ phổ biến nhất. Ngoài những đặc điểm
cần có, E. coli có chu kỳ sống ngắn, dễ nuôi cấy tạo sinh khối, dễ tạo thể đột biến có đặc tính
di truyền cần cho tạo dòng.
- E.coli được dùng cùng với các vector như plasmid, phage, cosmid, phagemid, NST
nhân tạo vi khuẩn.
- Các chủng E. coli dùng làm tế bào chủ phổ biến cho plasmid là JM109, DH5α,
NM522; cho phage là Y1089, Y1090,…
4. Tạo vector tái tổ hợp:
- Cắt vector và trình tự ADN cần tạo dòng với cùng một loại RE sau đó nối chúng lại
với nhau nhờ enzim ligase:

- Đối với các sản phẩm ADN được tạo ra nhờ PCR, trình tự cần tạo dòng ADN có thể
được vector dạng thẳng thông qua hoạt hóa topoisomerase liên kết ở 2 đầu mút của vector:

10


- Bên cạnh đó, dựa trên hiện tượng gắn chèn của phage λ vào bộ gen vi khuẩn, người
ta có thể nối insert với vector thông qua tái tổ hợp tại vị trí chuyên biệt giữa các trình tự attB
trên insert và attP trên vector:

III. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nhận.
- Vector tái tổ hợp có thể được đưa vào tế bào nhận nhờ phương pháp biến nạp hoặc
tải nạp.
- Phương pháp hóa biến nạp: Transformation ở vi khuẩn hay transfection ở tế bào
nhân thực bằng cách sử dụng hóa chất như muối CaCl 2 để biến tế bào chủ thành tế bào khả
nạp, có khả năng thu nhận vector từ môi trường.

- Phương pháp điện biến nạp (electroporation): Sử dụng xung điện cao thế để tạo các
“lỗ” tạm thời trên màng tế bào và màng nhân, qua đó các phân tử từ môi trường được chuyển
vào tế bào chất hay nhân. Ưu điểm của phương pháp này là hiệu quả chuyển gen cao và
nhanh, không bị giới hạn bởi kích thước vector và sử dụng được trên nhiều loại tế bào, kể cả
loại khó chuyển gen.
11


Trước khi dùng xung

Trong khi dùng xung

Sau khi dùng xung

- Phương pháp tải nạp (transduction):Sử dụng virus để chuyểnvector tái tổ hợp vào tế
bào (vi khuẩn, tế bào nhân thực) thông qua xâm nhiễm tự nhiên. Trong phương pháp này,
cần dịch “đóng gói” (packaging extract) có nguồngốc từ chủng E. coli cI857 tiềm tan, có
chứa cácthành phần cần để tạo đầu và đuôi của phần tửphage hoàn chỉnh.

IV. Chọn lọc dòng tế bào nhận có chứa ADN tái tổ hợp.
- Khi thực hiện giai đoạn chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào nhận, có 3 khả năng có
thể xảy ra:
(1) Tế bào chủ nhận được vector tái tổ hợp
(2) Tế bào chủ nhận được vector không tái tổ hợp
(3) Tế bào chủ không nhận được vector
12


- Có thể chọn lọc dòng tế bào nhận có chứa vector tái tổ hợp bằng các phương pháp
như: Sàng lọc xanh – tím, dùng kháng thể hay lai phân tử trên khuẩn lạc.
- Chọn lọc dòng bằng phương pháp sàng lọc xanh – tím:

13


- Chọn lọc dòng tế bào nhận cần tìm bằng kháng sinh: Được tiến hành theo các bước:
(1) Gene được tạo dòng trong vector biểu hiện.
(2) Cảm ứng biểu hiện protein.
(3) Chuyển protein biểu hiện lên màng nitrocellulose.
(4) Lai với kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp đánh dấu.
(5) Phát hiện protein mục tiêu.
(6) Từ đó thu nhận khuẩn lạc (đĩa tan) tương ứng.

14


- Chọn lọc dòng tế bào nhận cần tìm bằng lai phân tử trên khuẩn lạc hay đĩa tan: Dùng
mẫu dò để phát hiện dòng tế bào có mang gen cần tìm.

15


PHẦN B. MỘT SỐ CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1. Một thí nghiệm được thực hiện để tạo ra ADN tái tổ hợp giữa plasmid X và đoạn
ADN (Y).Plasmid X chứa gen Leu2 quy định tổng hợp Leucine, đoạn ADN Y có chứa gen
KanR- kháng kanamycin. Biểu đồ cấu trúc của X và Y được thể hiện dưới đây:

Plasmid X và đoạn ADN (Y) được thêm vào hỗn hợp phản ứng có chứa các enzim
giới hạn Bglll(5'-A * GATCT-3 '), BamHI (5'-G * GATCC-3'). Sau đó, các sản phẩm được
chuyển sanghỗn hợp phản ứng mới có chứa ligase. Các phân tử ADN được biến nạp vào vi
khuẩn Znhạy cảm với Kanamycin và không thể sống sót trong môi trường không có Leucine.
Sau đó nuôi cấy các vi khuẩn Z trong môi trường chứa Kanamycin và không chứa Leucine
để chọn lọc tế bào Z có chứa plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp sau đó đã được phân lập
từ môi trường nuôi cấy. Các phát biểu sau đúng hay sai, giải thích.
a. Nếu cắt plasmid sau khi chèn đoạn ADN Y bằng EcoRI sau đó đem điện di sẽ chỉ
thu được một băng điện di chứa các đoạn ADN kích thước 2800 bp.
b. Nếu trong hỗn hợp phản ứng, HindIII (5'-A * AGCTT-3 ') được sử dụng thay cho
BglII, vi khuẩn biến đổi có khả năng phát triển trên môi trường có chứa Kanamycin.
c. Đoạn ADN (Y) 500 bp có thể được loại bỏ khỏi plasmid tái tổ hợp bằng cách sử
dụng enzimgiới hạn BglII.
Hướng dẫn trả lời:
a. Sai vì đoạn ADN thu được có kích thước lớn hơn 2800 bp do có chứa thêm đoạn Y
b. Sai do đoạn ADN (Y) không thể chèn vào plasmid
c. Sai do vị trí cắt giới hạn của enzim HglII đã bị thay đổi.
Câu 2:Dưới đây là bản đồ giới hạn của plasmid pGEN101 (tổng chiều dài=20kb). Hãy
đưa ra số lượng và kích thước các phân đoạn được cắt bằng các enzyme riêng rẽ EcoRI,
BamHI, và kết hợp cả 2 loại enzme EcoRI + BamHI
16


DigestPerformed SizeofFragmentsObtained
EcoRI
BamHI
EcoRI+BamHI

Hướng dẫn trả lời:
DigestPerformed

Size ofFragments Obtained

EcoRI

20kb

BamHI

2 kb, 6kb, 12 kb

EcoRI+BamHI

2 kb, 4kb, 6kb,8 kb

Câu 3:Thực hiện cắt plasmid pBLA230 và thu được bảng số liệu sau:
DigestPerformed
HpaI
HindIII
HpaI+HindIII

SizeofFragmentsObtained
26kb
13kb,6kb,4kb,3kb
7kb,6kb(2),4kb,3kb

Xây dựng bản đồ giới hạn của pBLA230
Hướng dẫn trả lời:

Câu 4:Plasmid pBR607 dài 2.6kb và chứa gen kháng Ampicillin và Tetracyline, 1 ori, và
các vị trí cắt giới hạn của các enzyme EcoRI, BamHI, và PstI. Dựa trên bản đồ giới hạn của
pBR607, vẽ các phân đoạn tương ứng với kích thước của chúng trên bảng điện di gel agarose
sau khi thực hiện cắt bằng các enzyme EcoRI, BamHI, và PstI
17


Hướng dẫn trả lời:

18


Câu 5:Một học sinh xây dựng bản đồ giới hạn của plasmid pUC23 bằng cách sử dụng
enzyme cắt giới hạn EcoRI và BamHI. Sau khi thực hiện phản ứng cắt tại mỗi vị trí đơn lẻ và
phản ứng cắt đồng thời tại 2 vị trí kép, điện di gel agarose các sản phẩm của từng phản ứng.
Hình ảnh dưới đây cho biết số lượng và các phân đoạn ADN của mỗi phản ứng

Hướng dẫn trả lời:

Câu 6: Một plasmid AND vòng, pDA102, dài 4.35kb. Khi plasmid này được cắt bằng tổ
hợp các enzyme cắt giới hạn và điện di các phân đoạn thu được, ghi lại bảng dữ liệu dưới
19


đây. Sử dụng bảng dữ liệu này, xây dựng bản đồ giới hạn pDA102 với các vị trí cắt của
enzyme SalI, HhaIII
Enzyme
SalI
HhaIII
SalI+HhaIII

Độ dài các phân đoạn
2.30kb, 0.25kb, 1.80kb
2.10kb, 1.55kb, 0.70kb
1.20kb,1.10kb,0.75kb,0.70kb,0.35kb,0.25k
b

Hướng dẫn trả lời:

20



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×