Tải bản đầy đủ

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8683-13:2011

TCVN

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8683-13:2011
Xuất bản lần 1

GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y –
PHẦN 13: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN ĐÓNG DẤU
LỢN, CÁC CHỦNG E.37, E.47 VÀ E.80
Master seed of microorganisms for veterinary use –
Part 13: The procedure for preservation of Erysipelothrix rhusiopathiae,
E.37, E.47 and E.80 strains

HÀ NỘI

2011


TCVN 8683-13:2011


Lời nói đầu
TCVN 8683-13:2011 được chuyển đổi từ 10 TCN 269:1996 thành tiêu
chuẩn quốc gia theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn
và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số
127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi
hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;
TCVN 8683-13:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng
thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

3


TCVN 8683-13:2011

TIỂU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8683-13:2011

Giống vi sinh vật thú y –
Phần 13: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn,
các chủng E.37, E.47 và E.80
Master seed of microorganisms for veterinary use –
Part 13: The procedure for preservation of Erysipelothrix rhusiopathiae,
E.37, E.47 and E.80 strains

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên
quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an
toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng
tiêu chuẩn.

1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc giữ giống vi khuẩn dóng dấu lợn E.47, E.37 và E.80.

2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8684:2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y – Phép thử độ thuần khiết.



3 Yêu cầu đối với giống vi sinh vật
3.1 Nhận dạng
Kháng nguyên ổn định nhiệt của vi khuẩn phản ứng đặc hiệu với kháng huyết thanh đóng dấu lợn typA
(E.80) và typB (E.37, E.47) trong phản ứng miễn dịch khuếch tán.

4


TCVN 8683-13:2011
3.1.1 Chuẩn bị động vật
Chuẩn bị 2 con thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 1,8 kg đến 2,0 kg.
3.1.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn
Giống đông khô được hoàn nguyên bằng nước thịt. Ria lên thạch BAB có bổ sung 5 % huyết thanh
ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h. Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung 5 % huyết thanh
ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h.
Kháng nguyên, kháng huyết thanh được chuẩn bị như sau:
– Chuẩn bị kháng huyết thanh:
Canh khuẩn được cấy trên thạch BAB bổ sung huyết thanh ngựa ủ ở 37 0C trong 18 h đến 20 h. Rửa
mặt thạch bằng nước sinh lý 0,3 % formalin (PBS), thu huyễn dịch. Đếm số tế bào sao cho huyễn dịch
đạt mật độ vào khoảng 1 x 10 9 CFU/ml đến 2 x 109 CFU/ml. Thỏ được tiêm vào dưới da kháng nguyên
nói trên, mũi đầu tiêm liều 2 ml/con vào dưới da kháng nguyên chết, sau 2 tuần thỏ được tiêm tiếp với
các liều 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 2,5 ml; 3,0 ml kháng nguyên chết vào tĩnh mạch tai thỏ, các mũi
cách nhau 3 ngày đến 4 ngày. Một tuần sau mũi tiêm kháng nguyên chết cuối cùng, thỏ được tiêm vào
tĩnh mạch tai liều 0,5 ml kháng nguyên sống tương ứng. Từ 7 ngày đến 10 ngày sau mũi tiêm kháng
nguyên sống thỏ được lấy máu chắt huyết thanh và kiểm tra hiệu giá kháng thể 10 ngày sau khi tiêm mũi
cuối cùng (hiệu giá phải lớn hơn 1/512 thì lấy toàn bộ máu). Nếu hiệu giá kháng thể không đạt thì tiêm
tiếp 1ml kháng nguyên sống vào tĩnh mạch. Một tuần sau lấy máu thỏ kiểm tra hiệu giá kháng thể, nếu
đạt thì lấy máu toàn bộ, nếu không đạt thỏ đó được loại bỏ. Huyết thanh được bảo quản ở – 20 0C, một
lượng nhỏ có thể bảo quản ở nhiệt độ 4 0C. Huyết thanh được bổ sung 1/10000 merthiolat.
– Chuẩn bị kháng nguyên:
Canh khuẩn được cấy trên thạch BAB có huyết thanh ngựa 5 % ủ ở 37 0C trong 18 h đến 20 h. Rửa
mặt bằng nước sinh lý (PBS), thu huyễn dịch và vô hoạt bằng 0,3 % formol. Sau đó ly tâm 1000 - 2000
vòng trong 15 min ở 4 0C. Giữ cặn kháng nguyên hút bỏ nước trong và bảo quản ở – 20 0C. Cặn là xác
vi khuẩn được sử dụng như là kháng nguyên toàn thân. Pha kháng nguyên sao cho mật độ vi khuẩn
đạt khoảng 1 x 107 CFU/ml đến 3 x 107 CFU/ml.
– Chuẩn bị kháng huyết thanh:
Canh khuẩn được ria trên thạch BAB có bổ sung 5 % máu thỏ, ủ ở 37 0C trong 18 h đến 20 h. Rửa mặt
thạch bằng nước muối sinh lý 0,3 % formalin, thu hoạch huyễn dịch. Pha loãng sao cho huyễn dịch đạt
mật độ vi khuẩn vào khoảng ống Brown’s số 7. Thỏ được tiêm vào dưới da kháng nguyên nói trên, mũi
đầu tiêm liều 2 ml/thỏ vào dưới da kháng nguyên chết, sau mũi một 2 tuần thỏ được tiêm tiếp với các
liều 0,2 ml; 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml và cuối cùng là 2,0 ml kháng nguyên chết vào tĩnh mạch tai thỏ, các
5


TCVN 8683-13:2011
mũi cách nhau 3 ngày đến 4 ngày. Một tuần sau mũi tiêm kháng nguyên chết cuối cùng, thỏ được tiêm
vào tĩnh mạch tai liều 0,5 ml kháng nguyên sống tương ứng. 7 ngày đến 10 ngày sau mũi tiêm kháng
nguyên sống thỏ được lấy máu chắt huyết thanh và kiểm tra hiệu giá kháng thể 10 ngày sau khi tiêm
mũi cuối cùng (hiệu giá phải lớn hơn 1/512 thì lấy toàn bộ máu). Nếu hiệu giá kháng thể không đạt thì
tiêm tiếp 1 ml kháng nguyên sống vào tĩnh mạch. Một tuần sau lấy máu thỏ kiểm tra hiệu giá kháng
thể, nếu đạt thì lấy máu toàn bộ, nếu không đạt thỏ đó được loại bỏ. Huyết thanh được bảo quản ở –
20 0C, một lượng nhỏ có thể bảo quản ở nhiệt độ 4 0C. Huyết thanh được bổ sung 1/10000 merthiolat.
3.1.3 Cách tiến hành
Phản ứng được tiến hành trên đĩa 96 giếng đáy tròn.
Cho 50 µl nước sinh lý vào các giếng như bố trí A1 - D12, 50 µl kháng nguyên vào A1, B1 pha loãng
theo cơ số 2, 2 dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng hồng cầu. Ủ ở 37 0C trong 24 h rồi đọc kết quả.
Phản ứng âm tính nếu kháng nguyên lắng xuống đáy giếng thành cục tròn, nước ở trên trong.
Phản ứng dương tính nếu kháng nguyên ngưng kết như hình mạng nhện ở đáy giếng, hiệu giá ngưng
3.2 Đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn mọc tốt trên các môi trường VF, Martin, BHI ở 37 0C, pH từ 7,6 đến 7,8, môi trường đục đều,
không váng, không cặn.
3.3 Hình thái vi khuẩn
Vi khuẩn có dạng ngắn, mảnh, thẳng hoặc hơi cong, đứng riêng lẻ hoăc thành chuỗi ngắn, gram
dương, không nha bào, không giáp mô, không di động.
Trên thạch BAB có bổ sung 5 % huyết thanh ngựa khử bổ thể ở 37 0C trong 24 h đến 48 h khuẩn lạc
có dạng S nhỏ, trong như giọt sương.
Trên thạch máu cừu, khuẩn lạc có dạng tượng tự, không làm tan máu.
3.4 Kiểm tra tính độc
3.4.1 Chuẩn bị động vật
– 2 con lợn mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 20 kg đến 22 kg.
– 2 con thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 1,8 kg đến 2,0 kg.
– 2 con bồ câu khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 200 g đến 300 g.
– 5 con chuột nhắt trắng khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 18 g đến 20 g.
6


TCVN 8683-13:2011
3.4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn
Giống đông khô được hoàn nguyên bằng nước thịt. Ria lên thạch BAB có bổ sung 5 % huyết thanh
ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h. Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung 5 % huyết thanh
ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h. Đếm số xác định mật độ vi khuẩn và pha loãng đến các nồng độ cần tiêm.
3.4.3 Cách tiến hành
Tiêm cho lợn, liều từ 20 x 109 CFU/con đến 25 x 109 CFU/con theo đường tĩnh mạch, gây chết lợn.
Tiêm cho thỏ, liều 1 ml canh khuẩn pha loãng ở nồng độ 10–1 theo đường tĩnh mạch, gây chết thỏ.
Tiêm cho bồ câu, liều 1 ml canh khuẩn pha loãng ở nồng độ 10–6 theo đường bắp thịt, gây chết bồ câu.
Tiêm cho chuột nhắt trắng, liều 0,2 ml canh khuẩn pha loãng ở nồng độ 10 –7 theo đường dưới da, gây
chết chuột (MLD = 5 CFU/ml đến 10 CFU/ml).
3.5 Kiểm tra tính gây miễn dịch
3.5.1 Chuẩn bị động vật
Chuẩn bị 20 con chuột nhắt trắng khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 18 g đến 20 g.
3.5.2 Chuẩn bị canh khuẩn vô hoạt
Chọn khuẩn lạc cấy vào môi trường BHI bổ sung 5 % huyết thanh ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h.
Tiến hành vô hoạt canh khuẩn bằng formol từ 0,2 % đến 0,4 %. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày đến
3 ngày.
3.5.3 Cách tiến hành
Tiêm cho chuột, liều 0,2 ml theo đường dưới da. Chuột sống ít nhất 70 % sau khi được thử thách với
1000 MLD của hỗn hợp 2 chủng vi khuẩn đóng dấu lợn cường độc E.37 và E.80. Trong khi chuột đối
chứng (không tiêm canh khuẩn) chết 100 %.

4 Phương pháp truyền giống
4.1 Chuẩn bị động vật
Chuẩn bị 9 con lợn mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con có khối lượng từ 20 kg đến 22 kg.
4. 4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn

7


TCVN 8683-13:2011
Giống đông khô được hoàn nguyên bằng nước thịt. Ria lên thạch BAB có bổ sung 5 % huyết thanh
ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h. Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung 5 % huyết thanh
ngựa, ủ ở 37 0C trong 24 h.
4.3 Cách tiến hành
4.3.1 Ria lên thạch BAB có bổ sung 5 % huyết thanh.
4.3.2 Làm tiêu bản nhuộm gram để kiểm tra hình thái.
4.3.3 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc theo TCVN 8684:2011.
4.3.4 Tiêm cho lợn, liều từ 20 x 109 CFU/con đến 25 x 109 CFU/con, theo đường tĩnh mạch.
4.3.5

Chọn mổ những con lợn hấp hối hoặc ngay sau khi chết trong khoảng 24 h đến 48 h sau khi

tiêm. Thu hoạch máu tim.
4.3.6 Ria máu tim nên thạch BAB, ủ ở 37 0C trong 18 h đến 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào
môi trường BAB rồi lặp lại các bước từ 4.3.1 đến 4.3.5.
4.3.7 Ria máu tim lên thạch BAB, ủ ở 37 0C trong 18 h đến 20 h.
4.3.8 Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch máu cừu, ủ ở 37 0C trong 24 h.
4.3.9 Rửa mặt thạch bằng huyết thanh ngựa, thu huyễn dịch rồi đông khô.

5 Kiểm tra giống sau đông khô
5.1 Tiêu chuẩn vật lý
– Chế phẩm đóng thành bánh, xốp, màu đồng nhất, có chân không.
– Độ ẩm: không lớn hơn 4 %
– Độ hòa tan: khi lắc nhẹ trong nước sinh lý, chế phẩm tan trở lại dung dịch ban đầu trong vòng 2 min
đến 3 min.
5.2 Yêu cầu kỹ thuật
Giống đông khô phải đạt các yêu cầu trong Điều 3.

6 Bao gói, ghi nhãn và bảo quản
6.1 Bao gói

8


TCVN 8683-13:2011
Giống sau khi đông khô được bao gói bằng giấy, để trong túi nhựa.
6.2. Ghi nhãn
- Nơi sản xuất
- Tên giống
- Số lô…ngày…tháng…năm… sản xuất
- Người thực hiện
- Điều kiện bảo quản
6.3

Bảo quản

Giống giữ ở nhiệt độ từ 2 đến 8 0C được 2 năm.

9


TCVN 8683-13:2011

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Diseases of Swine (8th edition)/Chapters 31
[2] ASEAN standard: Swine erysipelas

10



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×