Tải bản đầy đủ

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8545:2010

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 8545 : 2010
THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN, NARASIN VÀ SALINOMYCIN –
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG VỚI DẪN XUẤT SAU CỘT
Animal feeding stuffs – Determination of monensin, narasin and salinomycin contents – Liquid
chromatographic method using post-column derivatization
Lời nói đầu
TCVN 8545:2010 hoàn toàn tương đương với ISO 14183:2005;
TCVN 8545:2010 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị,
Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN, NARASIN VÀ SALINOMYCIN
– PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG VỚI DẪN XUẤT SAU CỘT
Animal feeding stuffs – Determination of monensin, narasin and salinomycin contents –
Liquid chromatographic method using post-column derivatization
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng
monensin, narasin và salinomycin trong thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu bổ sung (dạng khô và
lỏng) và các premix khoáng. Phương pháp này không áp dụng đối với các premix thuốc (dược
phẩm). Phương pháp này không áp dụng để xác định lasalocid và semduramicin.
Giới hạn định lượng đối với monensin, narasin và salinomycin tương ứng khoảng 1mg/kg,
2mg/kg và 2 mg/kg. Giới hạn định lượng thấp hơn cũng có thể đạt được nhưng phải được thẩm

định bởi người sử dụng.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện
dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998) Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.
3. Nguyên tắc
Các thể mang ion (ionophore) monensin, narasin và salinomycin được chiết với hỗn hợp
metanol/nước (90 + 10) bằng máy lắc trong 1 h, sau đó dịch chiết được lọc. Các thể mang ion
được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo sử dụng dẫn xuất sau cột với
vanilin và phát hiện ở bước sóng 520 mm. Các mẫu dương tính nghi ngờ ở mức vết và các mẫu
thức ăn chăn nuôi bổ sung thuốc thú y có chứa các thể mang ion không dự kiến được khẳng
định bằng cách chiết với hexan hoặc tạo dẫn xuất sau cột với dimetylaminobenzaldehyt (DMAB).
4. Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.
4.1. Nước, loại dùng cho HPLC hoặc tương đương (ví dụ nước siêu sạch Milli-Q).
4.2. Metanol (CH3OH), loại dùng cho HPLC.
4.3. Axit sulfuric (H2SO4), 97 % đến 98 %.
4.4. Axit axetic (CH3COOH) băng, 97 % đến 98 %.
4.5. Natri hydrocacbonat (NAHCO3), độ tinh khiết tối thiểu 99 %.


4.6. Vanilin (4-hydroxy-3-metoxybenzaldehyt), độ tinh khiết tối thiểu 99 %.
4.7. Dimetylaminobenzaldehyt (DMAB), độ tinh khiết tối thiểu 99 %
4.8. Hexan [CH3(CH2)4CH3], được cất bằng dụng cụ thủy tinh.
4.9. Dung môi chiết, metanol/nước (90 + 10).
Trộn 1 800 ml metanol (4.2) và 200 ml nước (4.1) trong bình 2 lít, trộn đều.
4.10. Pha động
4.10.1. Hệ thống phản ứng sau cột
Vừa khuấy và thêm từ từ bằng pipet 20 ml axit sulfuric (4.3) vào 950 ml metanol (4.2). Để nguội,
vừa khuấy vừa thêm 30 g vanilin (4.6). Bảo quản tránh ánh sáng. Chuẩn bị mới trong ngày sử
dụng.
4.10.2. Cột HPLC
Hỗn hợp metanol (4.2)/nước (4.1)/axit axetic (4.4) (940 : 60 : 1). Lọc bằng chân không với hệ
thống nêu trong 5.7.
4.11. Metanol trung tính
Thêm 1,0 g natri hydrocacbonat (4.5) vào 4 lít metanol (4.2). Trộn đều và lọc qua giấy lọc 11 m,
nếu cần (ví dụ giấy lọc Whatman No.1) 1. Xem Chú thích ở 4.13.
4.12. Chất chuẩn
Thành phần hoặc nồng độ của từng lô chất chuẩn cần được biết.


4.12.1. Natri monensin2
4.12.2. Narasin2
4.12.3. Natri salinomycin3
CẢNH BÁO: Tránh bị hít vào hoặc tiếp xúc với các chất chuẩn và dung dịch chuẩn có độc
tính. Luôn làm việc trong tủ hút khói khi xử lí các loại dung môi và dung dịch thuốc thử.
Mang kính an toàn và quần áo bảo hộ.
4.13. Các dung dịch chuẩn gốc ionophore, khoảng 0,50 mg/ml.
Cân 25 mg mỗi loại chất chuẩn (từ 4.12.1 đến 4.12.3), chính xác đến 0,1 mg, vào các bình định
mức 50 ml. Hòa tan bằng metanol trung tính (4.11) và định mức đến vạch. Chuẩn bị mới dung
dịch chuẩn gốc hàng tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.
Bảo quản các dung dịch chuẩn tránh sáng hoặc chuẩn bị trong các bình thủy tinh sẫm màu.
CHÚ THÍCH: Việc sử dụng metanol trung tính chưa được xác nhận đối với salinomycin. Nếu chỉ phân tích riêng
monensin thì không yêu cầu, nhưng là bắt buộc nếu phân tích narasin.

4.13.1. Dung dịch chuẩn gốc monensin
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc monensin theo 4.13. Tính nồng độ dung dịch chuẩn gốc dựa vào
thành phần chính monensin A. Thành phần phụ monensin B trong mẫu thử, được rửa giải ngay
trước khi rửa giải monensin A [4], được xác định dựa vào monensin A. Sử dụng thành phần đã
nhận biết của chuẩn dựa theo chứng chỉ kèm theo và tính theo công thức:

1

 Đây là một ví dụ về sản phẩm thích hợp có sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng
tiêu chuẩn này còn ISO không ấn định phải sử dụng chúng
2
 Có sẵn tại Lilly Research Laboratories, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indina 46285, USA
3
 Có sẵn tại Alphama Inc., Animal Health Division, 1 Duggar Drive, Willow Island, WV, USA 26134-97111 và Hoechst
Roussel Vet, D-65926 Frankfurt am Main, Gebaude H 790, Germany


pM =

0,5 SM
100

Trong đó:
0,5 là nồng độ của dung dịch chuẩn gốc (4.13), tính bằng miligam trên mililít (mg/ml), được xác
định đến ba chữ số có nghĩa;

pM  là nồng độ của monensin A trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam trên mililít (mg/ml);
SM  là tỉ lệ của monensin A trong chất chuẩn đối chứng nêu trong chứng chỉ kèm theo, tính bằng
phần trăm (%).
VÍ DỤ Lô chất chuẩn RS0234 chứa 93,71 % monensin A, tính theo khối lượng.
4.13.2. Dung dịch chuẩn gốc salinomycin
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo 4.13. Tính nồng độ chuẩn gốc dựa vào nồng độ của chuẩn
đối chứng của nhà cung cấp đưa ra [2]:
ps

0,5 w
1000

Trong đó:

p s là nồng độ của salinomycin trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam trên mililit (mg/ml);
w là hàm lượng của chất chuẩn salinomycin do nhà cung cấp đưa ra, tính bằng microgam trên
miligam ( g / mg ).
VÍ DỤ Đối với lô WS-19B, hàm lượng chất chuẩn là 986 g/mg
4.13.3. Dung dịch chuẩn gốc narasin
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo 4.13. Tính nồng độ chuẩn gốc dựa vào thành phần chính là
narasin A. Những thành phần phụ (narasin D và l), được rửa giải sau narasin A [5], được xác định
dựa vào chuẩn narasin A. Sử dụng thành phần của chuẩn đã biết dựa vào chứng chỉ kèm theo
và tính theo công thức.
pN

0,5 SN
100

Trong đó:
PN là nồng độ của narasin A trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam trên mililít (mg/ml);
SN là tỉ lệ của narasin A trong chất chuẩn đối chứng nêu trong chứng chỉ kèm theo, tính bằng
phần trăm (%).
VÍ DỤ Đối với lô chất chuẩn RS0234, tỷ lệ phần trăm mỗi thành phần tính theo khối lượng là:
Narasin A = 85,4 %
Narasin D = 1,9 %
Narasin l = 0,7 %
4.14. Dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian, chứa monensin, salinomycin và narasin tương
ứng khoảng 20 g/ml, 40 g / ml và 40 g / ml .
Dùng pipet lấy 10,0 ml, 20,0 ml và 20,0 ml các dung dịch chuẩn gốc monensin, salinomycin và
narasin (4.13) tương ứng cho vào bình định mức 250 ml. Pha loãng đến vạch bằng dung môi
chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng.


4.15. Dung dịch hỗn hợp chuẩn cho HPLC
Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch hỗn hợp chuẩn HPLC bằng cách dùng pipet lấy các thể tích
hỗn hợp chuẩn trung gian (4.14) vào bình định mức sẫm màu dung tích 100 ml và pha loãng đến
vạch bằng dung môi chiết (4.9), như quy định trong Bảng 1. Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử
dụng trong tháng.
Bảng 1
Kí hiệu hỗn hợp
chuẩn HPLC

Thể tích hỗn hợp
chuẩn trung gian
(4.14) ml

Monensin

Salinomycin

Narasin

A

1

0,2

0,4

0,4

B

5

1

2

2

C

10

2

4

4

D

25

5

10

10

E

50

10

20

20

Nồng độ chuẩn cho HPLC g / ml

4.16. Các chuẩn riêng rẽ dùng cho HPLC
4.16.1. Monensin, khoảng 5 g / ml .
Dùng pipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc monensin (4.13.1) vào bình định mức
100ml sẫm màu. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch
để sử dụng trong tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.
4.16.2. Salinomycin, khoảng 10 g / ml .
Dùng pipet lấy chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc salinomycin (4.13.2) vào bình định mức
100ml sẫm màu. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch
để sử dụng trong tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.
4.16.3. Narasin, khoảng 10 g / ml
Dùng pipet lấy chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc narasin (4.13.3) vào bình định mức 100 ml
sẫm màu. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử
dụng trong tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.
5. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể
sau:
5.1. Hệ thống HPLC, bao gồm các bộ phận sau:
5.1.1. Bơm, đã khử xung, tốc độ dòng từ 0,1ml/min đến 2,0 ml/min.
5.1.2. Bộ phận bơm mẫu, bằng tay hoặc tự động, có khả năng bơm 100 l mẫu.
5.1.3. Detector UV/VIS, có bước sóng thay đổi, có thể đo ở bước sóng 520 nm và 592 nm.
5.1.4. Bộ tích phân, hoặc máy tính xử lí dữ liệu.
5.1.5. Bộ phận phản ứng sau cột, với cuộn dây phản ứng dung tích từ 1,5 ml đến 2,0 ml, có thể
gia nhiệt ở 98 oC.
Cuộn dây phản ứng có thể mua sẵn hoặc làm bằng ống loại 316 SS, đường kính trong 0,5 mm,
chiều dài từ 7,5 m đến 10 m, cuộn lại cho vừa với buồng gia nhiệt. Ví dụ, có thể cuộn ống phản
ứng trong giấy nhôm để vừa khít vào bộ phận gia nhiệt và truyền nhiệt tốt. Loại cuộn dây chế tạo
sẵn thường được ưa dùng. Để đảm bảo các loại thuốc thử trộn lẫn tốt với nhau, sử dụng máy lắc


trộn hoặc đầu nối trộn tĩnh (không phải dạng nối trộn thông thường) phía trước cuộn dây phản
ứng.
5.1.6. Bơm thuốc thử sau cột, đã khử xung, với tốc độ từ 0,5ml/min đến 2,0 ml/min.
5.1.7. Cột phân tích.
CHÚ THÍCH: Các loại cột C18 5 m, Nucleosil 120A 25 x 0,46 cm, Partisil 5 ODS-3 hoặc Waters
Nova Pak (4 m) hoặc tương đương đã được đánh giá là phù hợp 4.
5.1.8. Cột bảo vệ, C18.
5.2. Thiết bị thổi khí bằng nitơ, dùng để thổi dung môi sử dụng dòng khi nitơ.
5.3. Máy lắc, dạng tròn hoặc dạng xoắn.
5.4. Cân: Cân phân tích có thể cân 10 g hoặc lớn hơn với độ chính xác 0,1 mg và cân có thể cân
100 g hoặc lớn hơn với độ chính xác 0,01 g.
5.5. Bình nón, dung tích 125 ml, 250 ml và 500 ml, có nắp bằng thủy tinh.
5.6. Giấy lọc, Whatman No. 41 (15 cm), Whatman No. 42 (15 cm) và Whatman No. 1 (15 cm)
hoặc tương đương 4.
5.7. Bộ lọc dung môi, hoàn toàn bằng thủy tinh, dùng cho màng lọc 47 mm và màng lọc nylon
47 mm, cỡ lỗ 0,45 m
5.8. Bộ lọc mẫu, thiết bị dùng màng lọc nylon hoặc PTFE có cỡ lỗ 0,45

m

5.9. Rây, cỡ lỗ lỗ 1 mm.
6. Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi
trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497).
7. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).
Nghiền mẫu phòng thử nghiệm (> 200 g) để lọt qua rây có cỡ lỗ 1 mm. Đối với các mẫu có lượng
vết thì nghiền toàn bộ mẫu thử. Trộn kĩ.
8. Cách tiến hành
8.1. Chuẩn bị mẫu kiểm soát chất lượng
Nên sử dụng các mẫu kiểm soát chất lượng và các biểu đồ kiểm soát chất lượng.
Với mỗi dãy, thêm một mẫu bổ sung chuẩn có hàm lượng monensin, salinomycin và narasin
tương ứng khoảng 100 mg/kg, 50 mg/kg và 50 mg/kg (đối với mẫu bổ sung thuốc thú y) hoặc với
4 mg/kg, 6 mg/kg và 6 mg/kg (đối với mẫu có dạng vết).
VÍ DỤ 1 Thêm 4,0 ml chuẩn gốc monensin vào 20 g mẫu để có mẫu bổ sung chuẩn 100 mg/kg
và thêm 2,0 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc salinomycin và narasin vào 20 g mẫu bổ sung chuẩn
50mg/kg mỗi loại. Tất cả dung dịch gốc có nồng độ xấp xỉ như nhau (0,50 mg/ml, xem 4.13).
VÍ DỤ 2: Thêm 3,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian (4.14) vào 20 g mẫu để có mẫu bổ
sung chuẩn 3 mg/kg đối với monensin và 6 mg/kg đối với salinomycin và narasin.
Độ thu hồi đối với mẫu bổ sung thuốc thú y (> 10 mg/kg) phải nằm trong khoảng từ 95 % đến
108%. Độ thu hồi đối với mẫu dạng vết (< 10 mg/kg) phải nằm trong khoảng từ 90 % đến 110 %.
4

 Đây là các ví dụ về các sản phẩm thích hợp có sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn
này còn ISO không ấn định phải sử dụng chúng


8.2. Chiết mẫu
8.2.1. Mẫu thức ăn chăn nuôi khô và các premix chứa < 5000 mg/kg
Cân chính xác 20 g mẫu thử vào bình nón 250 ml. Đối với các premix khoáng, thêm 5 g natri
hydrocacbonat. Thêm 100 ml dung môi chiết (4.9). Đậy nắp và lắc mạnh trong 1 h bằng máy lắc
(5.3).
8.2.2. Mẫu thức ăn chăn nuôi khô và các premix chứa > 5000 mg/kg
Cân chính xác 5 g mẫu vào bình nón 500 ml. Đối với mẫu premix khoáng, thêm 2 g natri
hydrocacbonat. Thêm 200 ml dung môi chiết (4.9). Đậy nắp và lắc mạnh trong 1 h bằng máy lắc
(5.3).
8.2.3. Mẫu dạng lỏng
Đồng hóa mẫu bằng cách khuấy mẫu trên máy khuấy từ hoặc máy khuấy trộn. Lấy 20 ml mẫu
dạng lỏng cho vào một ống đong chia độ 25 ml đã biết khối lượng. Cân và chuyển mẫu vào bình
nón 500 ml. Thêm 180 ml metanol (4.2) (dùng một ít để tráng ống đong). Đậy nắp bình nón và lắc
mạnh trong 1 h bằng máy lắc (5.3).
8.2.4. Lọc dịch chiết
Lọc dịch chiết qua giấy lọc Whatman No.41 (5.6) vào một bình nón 125 ml.
Đối với dịch chiết có nồng độ kháng sinh ionophore cao, pha loãng đến nồng độ tương đương
với chuẩn D cho HPLC (4.15). Hệ số pha loãng D có thể được tính theo công thức sau:
D=

ws
pstd

mt
Ve

Trong đó:
Ws là nồng độ kháng sinh trong mẫu, tính bằng kilogam trên mililít (mg/kg);
Pstd là nồng độ của chuẩn dùng cho HPLC, tính bằng microgam trên mililít ( μg/ml );
mt là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
Ve là thể tích dịch chiết, tính bằng mililít (ml).
Lọc dịch chiết nói trên hoặc rửa giải qua màng lọc 0,45 m trước khi phân tích trên HPLC.
8.3. Phân tích HPLC
8.3.1. Điều kiện sắc kí
a) Các thông số phân tách bằng HPLC
- cột sắc kí:

theo 5.1.7

- pha động:

theo 4.10.2

- tốc độ dòng:

0,7 ml/min

- bước sóng detector:

520 nm

- tốc độ ghi:

0,5 cm/min

- thể tích bơm:

100 μl

- cột bảo vệ:

theo 5.1.8 (chú ý thường xuyên thay mới cột bảo vệ, nhất là đối với
mẫu dạng vết)

- độ nhạy máy ghi:

được điều chỉnh để có được độ chệch từ 50 % đến 60 % trên toàn
thang đo đối với chuẩn B cho HPLC (4.15) đối với mẫu có chứa mức
thấp và chuẩn D cho HPLC đối với mẫu bổ sung thuốc thú y.


b) Điều kiện phản ứng sau cột:
- bộ phận phản ứng sau cột:

Theo 5.1.5

- pha động :

Theo 4.10.1

- tốc độ dòng:

0,9 ml/min

- nhiệt độ buồng phản ứng:

98 oC

Cần đáp ứng các tiêu chí về sự phù hợp của hệ thống theo 8.3.2. Cả ba chất chuẩn ionophore và
các thành phần phụ phải được phân giải tốt trong điều kiện sắc kí, tuy nhiên, thành phần phụ của
salinomycin có thể xuất hiện như một pic biên đứng phía trước pic narasin. Sử dụng cột
Nucleosil (5.1.7) với các điều kiện như trên, thời gian lưu tương ứng đối với monensin B,
monensin A, salinomycin, narasin A và narasin (D + l) phải xấp xỉ 8,7 min, 9,8 min, 11,2 min,
12,8min và 14,6 min.
Tốc độ dòng và pha động đối với cột phân tích có thể dao động nhẹ, tuy nhiên tổng tốc độ dòng
phải nằm trong khoảng từ 1,5 ml/min đến 1,6 ml/min để cho phép thời gian phản ứng ít nhất là
1min. Độ nhạy được xác định bởi các điều kiện phản ứng và tín hiệu detecor/nhiễu.
Maduramicin là một chất cản trở chính khi mẫu phân tích có dạng vết đối với salinomycin;
maduramicin được rửa giải khoảng 0,3 min trước salinomycin. Semduramicin là chất cản trở
chính khi phân tích monensin; nó được rửa giải khoảng 0,4 min trước monensin B. Cả
maduramicin và semduramicin cho thấy độ nhạy thấp và có thể xử lí hiệu quả bằng quy trình
khẳng định trong Điều 9.
8.3.2. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống
8.3.2.1. Độ phân giải
Bơm hỗn hợp chuẩn D dùng cho HPLC (4.15).
Tính hệ số phân giải FR đối với các cặp pic cạnh nhau như sau:
d

FR =2

d
2
1
w w
1
2

Trong đó:
dn là khoảng cách trên đường nền giữa điểm bắt đầu của sắc đồ và cực đại của pic, tính bằng
centimet (cm);
wn là độ rộng pic trên đường nền, tính bằng centimet (cm);
n là số của pic (n=1 hoặc 2).
VÍ DỤ Dữ liệu để tính độ phân giải giữa monensin B (1) và monensin A (2):
d1 = 10,38 cm, w1 = 0,46 cm;
d2 = 11,98 cm, w2 = 0,52 cm;
FR =2

11,98 10,38
= 3,3
0,46 0,52

Giá trị FR phải lớn hơn 1,4 đối với tất cả các cặp pic cạnh nhau. Nếu tiêu chí này không được đáp
ứng, điều chỉnh các điều kiện HPLC để cải thiện độ phân giải, sau đó lặp lại việc bơm chuẩn và
tính.
8.3.2.2. Hệ số đuôi pic
Tính hệ số đuôi pic FT theo công thức sau:


FT =

tb
2 (t

ta
ta )

Trong đó:
t là thời gian lưu của pic (thời gian cực đại của đường cong Gauss), tính bằng phút (min);
ta là thời gian lưu khi pic đạt độ cao bằng 5 % của cực đại pic;
tb là thời gian lưu khi pic đi xuống và đạt độ cao bằng 5 % của cực đại pic;
Hệ số đuôi pic FT đối với monensin A, salinomycin và narasin phải nhỏ hơn 1,4.
8.4. Xác định
8.4.1. Bơm lặp lại 100 μl hỗn hợp chuẩn D dùng cho HPLC (4.15) hoặc các chuẩn đơn (4.16)
thích hợp đến khi độ lặp lại của diện tích pic nằm trong khoảng ± 1 % và đường nền ổn định.
Bơm 5 μl mỗi dung dịch chuẩn gốc nếu cần để định tính tất cả các pic. Kiểm tra độ tuyến tính
bằng cách bơm 100 μl mỗi dung dịch chuẩn HPLC hỗn hợp A, B, C, D và E (4.15). Đường
chuẩn hồi quy tuyến tính (hệ số tương quan không nhỏ hơn 0,999) và điểm cắt trục tung cách
giao điểm zero không đáng kể.
Việc định lượng có thể thực hiện bằng cách sử dụng một điểm chuẩn hoặc một đường chuẩn.
Cách sử dụng đường chuẩn thường được sử dụng nhiều hơn.
Đối với việc định lượng bằng một điểm chuẩn, khi phân tích mẫu bổ sung thuốc thú y cần sử
dụng chuẩn đơn thích hợp (4.16) (chỉ dùng hỗn hợp chuẩn khi phân tích nhiều loại ionophore).
Đối với mẫu thử dạng vết, dùng hỗn hợp chuẩn B dùng cho HPLC (4.15) để định lượng. Bơm lại
dung dịch chuẩn sau 8 đến 10 lần bơm dung dịch mẫu thử.
Đối với việc định lượng bằng đường chuẩn, bơm dãy chuẩn HPLC (4.15) lúc ban đầu và kết thúc
phân tích mẫu. Dựng đường chuẩn hồi quy tuyến tính.
Bơm 100 μl dung dịch mẫu thử. Xác định diện tích pic. Nếu diện tích pic lớn hơn pic chuẩn đơn
hoặc nằm ngoài dãy chuẩn thì pha loãng dung dịch mẫu thử bằng dung môi chiết (4.9). Không
giảm thể tích mẫu bơm vào.
CHÚ THÍCH: Do dung dịch mẫu thử không được làm sạch nên thời gian lưu có thể dài hơn đến
0,5 min so với thời gian lưu của pic chuẩn. Điều này chủ yếu xảy ra đối với monensin. Tuy nhiên,
sự có mặt có pic monensin B thường khẳng định sự có mặt của monensin. Nếu có nghi ngờ, có
thể định tính pic bằng cách thêm chuẩn vào dung dịch mẫu thử hoặc khẳng định bằng thuốc thử
DMAB (9.2) hoặc chiết bằng hexan (9.3).
8.4.2. Trình tự tắt hệ thống như sau: tắt bơm thuốc thử sau cột trước khi tắt bơm dung môi
HPLC để đề phòng dòng thuốc thử sau cột chạy ngược vào cột sắc kí. Rửa cột và bộ phận phản
ứng 30 min đến 45 min bằng metanol (4.2).
9. Khẳng định bằng HPLC
9.1. Yêu cầu chung
Các mẫu thử dương tính ở mức vết và các mẫu bổ sung thuốc thú y có chứa các ionophore
không dự kiến cần được khẳng định để xác nhận việc nhận biết chính xác các pic. Có thể áp
dụng một trong hai quy trình sau đây, tuy nhiên quy trình dùng thuốc thử DMAB là tốt nhất. Việc
chiết bằng hexan không thể áp dụng đối với các mẫu premix khoáng hoặc mẫu dạng lỏng và các
kết quả khi sử dụng hexan ít có giá trị định lượng (chỉ khoảng 90 %), nhưng với mẫu phức tạp thì
sắc đồ được cải thiện đáng kể (ít các pic nhiễu). Xem 10.5 về cách diễn giải các kết quả.
9.2. Dẫn xuất sau cột bằng DMAB
Quy trình này có thể áp dụng cho tất cả các loại mẫu thức ăn chăn nuôi

[6].


Tiến hành các bước từ 8.1 đến 8.4 và các điều kiện HPLC (8.3.1), nhưng sử dụng các thông số
phản ứng sau cột như sau:
a) Thông số phản ứng sau cột:
- tốc độ thuốc thử:

0,8 ml/min

- nhiệt độ buồng phản ứng:

95 oC

- bước sóng:

592 nm.

b) Thuốc thử sau cột (pha động):
- vừa khuấy nhẹ vừa thêm 20 ml axit sulfuric (4.3) vào 950 ml metanol (4.2)
- để nguội, vừa khuấy vừa thêm 30 g DMAB (4.7)
- tránh ánh sáng, chuẩn bị mới trong ngày sử dụng.
9.3. Chiết bằng hexan
Quy trình này không áp dụng đối với mẫu chứa khoáng hoặc mẫu dạng lỏng.
Cân chính xác 20 g mẫu vào bình nón 250 ml. Thêm 100 ml hexan (4.8). Đậy nắp và lắc qua
đêm bằng máy lắc (5.3). Lọc dung dịch mẫu qua giấy lọc Whatman No. 42 (5.6) vào bình nón
125 ml. Dùng pipet lấy 10 ml dịch chiết vào ống nghiệm và cho bay hơi đến khô sử dụng thiết bị
thổi khí bằng nitơ (5.2). Hòa tan phần còn lại trong 10 ml dung môi chiết (4.9). Lọc dịch chiết
trước khi tiến hành phân tích bằng HPLC (8.3).
10. Tính kết quả
10.1. Yêu cầu chung
Tính hàm lượng ionophore trong mẫu bằng cách so sánh diện tích pic của mỗi mẫu với diện tích
pic trung bình của dung dịch chất chuẩn trước và sau khi bơm mẫu (phương pháp một điểm
chuẩn). Đối với monensin và narasin thì các kết quả được tính theo hoạt tính kháng khuẩn bằng
cách dùng các hệ số hiệu quả sinh học. Kết quả đối với salinomycin được biểu thị theo tỉ lệ khối
lượng.
10.2. Monensin
Hàm lượng monensin (mg/kg) tương đương với giá trị sinh học của monensin A + B.
Giá trị sinh học, B, của mỗi thành phần, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo
công thức sau:
BM =

AM
AAs

pAs

V
m

D FM

Trong đó:
AM là diện tích pic thu được của monensin A hoặc B trong dung dịch mẫu thử;
AAS là diện tích pic của monensin A trong dung dịch chuẩn (trung bình);
pAS là nồng độ của monensin A trong dung dịch chuẩn tính bằng microgam trên mililit ( μg/ml );
m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
V là thể tích dịch chiết hoặc tổng thể tích mẫu (đối với mẫu dạng lỏng), tính bằng mililit (ml);
D là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);
FM là hệ số hiệu quả sinh học của thành phần đã biết (monensin A hoặc B), thể hiện mối tương
quan giữa giá trị HPLC với hoạt tính kháng khuẩn:
FA = 1,00


FB = 0,28
Hoạt tính tổng số của monensin bằng BA+ BB, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg).
Để tính độ thu hồi của monensin trong mẫu bổ sung chuẩn, không sử dụng hệ số FM trong công
thức.
Đối với mẫu dạng vết, có thể không xác định được monensin B.
Nồng độ của monensin B trong dung dịch thử được tính theo chuẩn monensin A. Xem ví dụ cụ
thể và cách tính.
VÍ DỤ:
Khối lượng phần mẫu thử (m)

= 20,00 g

Thể tích chiết (V)

= 100 ml

Hệ số pha loãng (D)

=4

Nồng độ monensin A trong dung dịch chuẩn HPLC (pAS)

=5,05 g/ml

Diện tích pic trung bình của monensin A trong dung dịch chuẩn HPLC (AAS)

= 1 479 566

Diện tích pic monensin A trong dung dịch mẫu thử (AA)

= 1 450 878

Diện tích pic monensin B trong dung dịch mẫu thử (AB)

= 67 091

BA =

1450878
100
5,05
4 1,00 99,04 mg/kg
1479566
20,00

BB =

67091
100
5,05
4 0,28 1,3 mg/kg
1479566
20,00

Tổng hàm lượng monensin = 99,0 + 1,3 = 100,3 mg/kg
10.3. Salinomycin
Hàm lượng salinomycin trong mẫu, ws, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo
công thức sau:
ws =

A
As

V

ps

mt

D

hoặc:
ws = pt x

V
mt

D

Trong đó:
A là diện tích pic của salinomycin trong dung dịch mẫu thử.
As là diện tích pic của salinomycin trong dung dịch chuẩn HPLC (trung bình);
Ps là nồng độ chuẩn salinomycin trong dung dịch chuẩn HPLC, tính bằng microgam trên mililit
( g/ml);
mt là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
V là thể tích chiết, tính bằng mililit (ml);
D là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);


pt là nồng độ salinomycin trong dung dịch mẫu thử xác định từ đường chuẩn, tính bằng
microgam trên mililit ( g/l).
VÍ DỤ:
Khối lượng phần mẫu thử (m)

= 20,00 g

Thể tích chiết (V)

= 100 ml

Hệ số pha loãng (D)

=1

Nồng độ salinomycin trong dung dịch chuẩn HPLC (pS)

=10,55 g/ml

Diện tích pic salinomycin trong dung dịch chuẩn (As)

= 1 575 475

Diện tích pic salinomycin trong dung dịch chuẩn (A)

= 1 568 882

ws =

1568882
100
10,55
10 52,5 mg/kg
1575475
20,00

10.4. Narasin
Hàm lượng narasin (mg/kg) tương đương với giá trị sinh học của narasin [A + (D + l)].
Giá trị sinh học của mỗi thành phần, B, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo
công thức sau:
A

N

BN =

AAS

p AS

V

D F
N

mt

hoặc:
BN = pN x

V
mt

D F
N

Trong đó:
AN là diện tích pic thu được của narasin A hoặc (D+l) trong dung dịch mẫu thử;
AAS là diện tích pic của narasin A trong dung dịch chuẩn (trung bình);
pAS là nồng độ của narasin A trong dung dịch chuẩn, tính bằng tính bằng microgam trên mililit
( g/ml);
mt là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
V là thể tích dung môi, tính bằng mililit (ml);
D là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);
FN là hệ số hiệu quả sinh học của narasin [A hoặc (D + l)];
pN là nồng độ narasin trong dung dịch mẫu thử tính từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên
mililit ( g/ml);
FA = 1,077
FD+l được tính theo công thức sau:
F(D+l) =
Trong đó:

c DS 1,510
cis

cis
cis

0,012


cDs là hàm lượng narasin D trong chuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);
cis là hàm lượng narasin l trong chuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);
và hệ số hiệu quả sinh học đối với từng đồng phân là:
FD = 1,510;
Fl = 0,012.
Xem phần Hồ sơ chất chuẩn đối chứng về phần trăm của các đồng phân A, D và l trong chuẩn
đối chứng sử dụng.
Nồng độ của các đồng phân (D + l) trong dịch chiết mẫu được tính theo đồng phân A trong dung
dịch chuẩn. Xem ví dụ về cách tính.
VÍ DỤ 1: Đối với lô chuẩn đối chứng RS0302, cDs = 1,9 % và cis = 0,7 %
FD+l =

(1,9 1,510) (0,7 0,012)
1,9 0,7

1,11

Để tính tỷ lệ phần trăm thu hồi của narasin trong mẫu bổ sung chuẩn, không sử dụng hệ số Fn
trong công thức tính. Đối với mẫu dạng vết, có thể không xác định được narasin (D + l).
VÍ DỤ 2
Khối lượng phần mẫu thử (m)

= 20,00 g

Thể tích dung môi (V)

= 100 ml

Hệ số pha loãng (D)

= 1,0

Nồng độ narasin trong dung dịch chuẩn HPLC (pAs)

= 10,60 g/ml

Diện tích pic trung bình narasin A trong chuẩn HPLC (A AS)

= 1 559 626

Diện tích pic narasin A trong dung dịch mẫu (A A)

= 1 539 393

Diện tích pic narasin (D + l) trong dung dịch mẫu (A D+l)

= 77 376

BN =

BN =

1539393
100
10,60
1 1,077
1559626
20,00

56,3 mg/kg

77376
100
10,60
1 1,11 2,92 mg/kg
1559626
20,00

Hàm lượng narasin tổng số = 56,3 + 2,9 = 59,2 mg/kg
Báo cáo các kết quả cuối cùng đến hai chữ số có nghĩa nếu < 10 mg/kg và đến ba chữ số có
nghĩa nếu > 10 mg/kg. Các mẫu thử dương tính ở mức vết và các mẫu bổ sung thuốc thú y nghi
ngờ có chứa các ionophore không dự kiến cần được khẳng định. Xem Điều 9.
10.5. Diễn giải kết quả khẳng định mẫu dương tính
Khi khẳng định bằng cách dùng DMAB làm thuốc thử sau cột, các kết quả đối với các ionophore
phải phù hợp với những kết quả thu được khi dùng vanilin. Tuy nhiên, kích cỡ pic của từng
ionophore khi dùng DMAB phải lớn hơn 1,3 lần đến 1,5 lần so với kết quả thu được khi dùng
vanilin. Tỷ lệ cỡ pic đối với DMAB/vanilin đối với mẫu thử phải phù hợp với chất chuẩn.
Nếu nghi ngờ có maduramicin ở thời gian lưu giống với salinomycin thì kết quả thu được sử
dụng DMAB phải thấp hơn đáng kể vì maduramicin kém nhạy hơn salinomycin khoảng 6 lần. Một
mẫu chứa maduramicin với hàm lượng 5 mg/kg sẽ cho một pic có tín hiệu tương đương với mẫu
chứa salinomycin với hàm lượng 1 mg/kg; nghĩa là thấp hơn giới hạn định lượng salinomycin.


Nếu có mặt semduramicin thì phải có một pic ngay trước monensin B. Khi dùng vanilin để khẳng
định thì semduramicin kém nhạy hơn khoảng 13 lần so với cả monensin A và B. Khi dùng DMAB
thì semduramicin kém nhạy hơn monensin khoảng 28 lần.
Khi khẳng định bằng cách chiết với hexan, các kết quả đối với ba loại ionophore chỉ được sai
lệch trong vòng 10 % so với kết quả khi chiết bằng metanol 90 %. Nếu có mặt maduramicin hoặc
semduramicin, phương pháp chiết bằng hexan cho kết quả từ 40 % đến 50 % so với kết quả thu
được khi chiết bằng metanol.
Các thông tin nói trên cần được thẩm định lại đối với mỗi hệ thống HPLC cụ thể.
Việc định tính pic được khẳng định bằng quy trình ở Điều 8 nếu thời gian lưu của chuẩn và mẫu
khác nhau không quá 0,2 min và kết quả định lượng nằm trong khoảng ± 5 % (vanilin so với
DMAB) và ± 10 % (chiết bằng 90 % metanol so với chiết bằng hexan).
11. Độ chụm
11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm
Chi tiết về phép thử liên phòng nghiệm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị
thu được từ phép thử liên phòng nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và
chất nền khác.
11.2. Độ lặp lại
Chêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị
trung bình, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau,
trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng
thời gian ngắn, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ lặp lại (r) thu được bằng
công thức sau (9);
r = 2 x 21/2 x RSD(r) = 2,8 x RSD (r)
trong đó RSD(r) là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại.
Các giá trị độ lặp lại giống nhau đối với cả 3 chất phân tích, xem ở Bảng 2.
11.3. Độ tái lập
Chêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung
bình, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau,
trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết
bị khác nhau, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ tái lập (R) thu được bằng
công thức sau [9];
R= 2,8 x RSD(R)
Trong đó RSD(R) là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.
Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập đối với mẫu bổ sung thuốc thú y (> 10 mg/kg), chế phẩm bổ
sung và các premix khoáng chất theo các bảng A.1, A.2 và A.3, được nêu trong Bảng 2.
Bảng 2
Thông số

Monensin

Narasin

Salinomycin

RSD(r), tối đa

5,23

4,46

4,31

RSD(r), trung bìnha

4,01

3,99

4,77

r, %, tối đa

14,6

12,5

12,1

r, %, trung bìnha

11,2

11,2

9,46

RSD(R), tối đa

6,75

6,54

5,67

RSD(R), trung bìnha

5,21

5,65

4,72


R, %, tối đa

18,9

18,3

15,9

R, %, trung bìnha

14,6

15,8

13,2

a

Các giá trị trung bình được xác định bằng phân tích biến sai. Số liệu nghiên cứu cho thấy sự
dao động của phép phân tích không phụ thuộc vào nồng độ của chất phân tích và loại mẫu thử.
Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập tương tự cũng thu được ở mẫu thức ăn chăn nuôi dạng vết, trừ
các mẫu chứa hàm lượng monensin 3 mg/kg (có thể do mẫu kém đồng nhất).
11.4. Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng thực nghiệm là 1 mg/kg đối với monensin và 2 mg/kg đối với narasin và
salinomycin. Có thể đạt được giới hạn định lượng thấp hơn tùy thuộc hệ thống HPLC được sử
dụng và phải được người sử dụng phương pháp đánh giá hiệu lực.
12. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;
- phương pháp thử đã dùng, cũng như viện dẫn tiêu chuẩn này;
- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với
các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
- kết quả thử nghiệm thu được;
- kết quả cuối cùng thu được nếu kiểm tra độ lặp lại.

PHỤ LỤC A
(Tham khảo)
CÁC KẾT QUẢ THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM
A.1. Cách tiến hành
Một phép thử liên phòng thử nghiệm được tổ chức và thực hiện theo Hướng dẫn thử liên phòng
thử nghiệm của AOAC quốc tế [9.10] năm 2002. Các mẫu thử được chuẩn bị bằng cách nghiền
một lượng thích hợp từ nguyên liệu thử dạng khô bằng thiết bị Retsch ZM1 (lỗ sàng 0,75 mm)
hoặc Retsch SR3 (lỗ sàng 1,0 mm). Nguyên liệu sau khi nghiền được trộn đều bằng tay sau đó
chia làm nhiều phần trên thiết bị chia mẫu Retsch rotary PTZ, mỗi phần khoảng 50 g. Độ đồng
nhất của mẫu con được đánh giá bằng cách phân tích 6 mẫu chọn ngẫu nhiên: nguyên liệu thử
được coi là đồng nhất nếu độ lệch chuẩn tương đối lặp lại nhỏ hơn 2 %.
Các phòng thử nghiệm tham gia được lựa chọn dựa trên các kết quả từ nghiên cứu thành thạo
phương pháp bao gồm cả tính phù hợp của hệ thống và phân tích 2 mẫu trong đó 1 mẫu có
chứa monensin và 1 mẫu chứa salinomycin. Phạm vi nghiên cứu của phương pháp là trên mẫu
thử dạng vết (1 mg/kg) đến premix bổ sung thuốc thú y (200 g/kg). Hai mươi lăm mẫu bổ sung
thuốc thú y, chín mẫu dạng vết và các mẫu chuẩn đối chứng của ba loại kháng sinh được gửi
đến các phòng thử nghiệm tham gia. 10 phòng thử nghiệm đã gửi lại số liệu được chấp nhận
trong khoảng thời gian phù hợp. Số liệu từ một phòng thử nghiệm bị loại do không đảm bảo một
số yêu cầu của phép thử nghiệm đặt ra.
Các mẫu được thử như sau:
a) Các mẫu bổ sung thuốc thú y (tất cả đều được gửi ở dạng mẫu mù)
Monensin

Narasin

salinomycin


2 mẫu thức ăn hoàn chỉnh, lặp
lại

2 mẫu thức ăn hoàn chỉnh, lặp
lại

3 mẫu thức ăn hoàn chỉnh, lặp
lại

1 mẫu thức ăn bổ sung, lặp lại

1 mẫu hỗn hợp có bổ sung
thuốc, mẫu đơn.

1 mẫu thức ăn bổ sung, mẫu
đơn

1 mẫu bổ sung dạng lỏng, lặp
lại

1 mẫu premix khoáng, lặp lại

1 mẫu premix khoáng, mẫu
đơn

1 mẫu hỗn hợp có bổ sung
thuốc, mẫu đơn

1 mẫu hỗn hợp có bổ sung
thuốc, mẫu đơn
b) Mẫu dạng vết (tất cả đều được gửi ở dạng mẫu mù)
1 mẫu thức ăn hoàn chỉnh chứa monensin và narasin, lặp lại
1 mẫu thức ăn hoàn chỉnh chứa salinomycin, làm lặp lại
1 mẫu thức ăn bổ sung dạng lỏng có chứa monensin, mẫu đơn
4 mẫu trắng thức ăn hoàn chỉnh.
Kỹ thuật khẳng định mẫu dương tính (dùng thuốc thử sau cột để thay thế) đã được cung cấp
trong thử nghiệm này. Các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu áp dụng kỹ thuật đó để
khẳng định lại đối với tất cả các mẫu dương tính dạng vết.
A.2. Phân tích thống kê các kết quả
Các kết quả thử nghiệm đã được kiểm tra xem có dấu hiệu mắc sai lỗi hệ thống nào không bằng
cách sử dụng các phép thử Cochran và Grubbs theo các quy trình được mô tả trong Hướng dẫn
nghiên cứu liên phòng thử nghiệm [9.10]. Việc tính các giới hạn độ lặp lại (r) và giới hạn độ tái lập
(R) theo hướng dẫn [9.10] được thực hiện sau khi đã loại trừ ngoại lệ. Các giá trị Horrat, tỉ số giữa
độ lệch chuẩn tương đối tái lập thu được với độ lệch chuẩn tương đối tái lập dự kiến đã được
tính. Các giá trị Horrat dao động trong khoảng từ 0,5 đến 1,5 là chấp nhận được [10] . Các dữ liệu
về phương pháp tính (độ lặp lại, độ tái lập và giá trị Horrat) được nêu trong các Bảng từ A.1 đến
A.3.
Bảng A.1 – Các kết quả thử nghiệm liên phòng đối với monensin
Thông số

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Số phòng thử
nghiệm còn lại
sau khi đã loại
trừ ngoại tệ

10

10

9

10

10

9

9

8

10

8

Hàm lượng
monensin trung
bình, mg/kg

97,0

37,5

254

430

1810

178000

5,8

5,8

3,1

3,2

Độ lệch chuẩn
lặp lại (sr), mg/kg

3,93

1,37

13,3

11,6

-

-

-

-

0,296

0,083

Độ lệch chuẩn
tương đối lặp lại,
%

4,05

3,66

5,23

2,69

-

-

-

-

9,50

2,58

Giới hạn lặp lại
(r), % của hàm
lượng trung bình

11,3

10,2

14,6

7,53

-

-

-

-

26,7

7,25

Giới hạn lặp lại

11,0

3,84

37,2

32,4

-

-

-

-

0,828

0,232


(r), mg/kg
Độ lệch chuẩn
tái lập (sR),
mg/kg

3,61

2,04

16,6

20,3

122a

10500a

0,412a

0,462a

0,346

0,421

Độ lệch chuẩn
tương đối tái lập,
%

3,72

5,44

6,56

4,72

6,75a

5,90a

7,15a

7,93a

11,1

13,1

Giới hạn tái lập
(R), % của hàm
lượng trung bình
được xác định

10,4

15,2

18,3

13,2

18,9a

16,5a

19,8a

20,7a

31,2

36,9

Giá trị Horrat

0,50

0,59

0,94

0,74

1,30a

2,28a

0,58a

065a

0,82

0,97

Thử nghiệm mẫu bổ sung thuốc thú y:

Thử nghiệm mẫu dạng vết:

Mẫu 1: thức ăn cho gà tây

Mẫu 7: thức ăn bổ sung dạng lỏng/vanilin

Mẫu 2: thức ăn cho bò sữa

Mẫu 8: thức ăn bổ sung dạng lỏng/DMAB

Mẫu 3: thức ăn bò thịt

Mẫu 9: thức ăn cho bò thịt/vanilin

Mẫu 4: thức ăn bổ sung dạng lỏng

Mẫu 10: thức ăn cho bò thịt/DMAB

Mẫu 5: premix cho bê tơ cái (premix khoáng)
Mẫu 6: thức ăn có rumensin (premix thuốc)
a

Số liệu độ lệch chuẩn và các thông số liên quan được báo cáo lại vì thiếu số liệu lặp lại hai lần
trong mỗi phòng thử nghiệm (các kết quả thử nghiệm được cung cấp dưới dạng mẫu đơn).
Bảng A.2 – Các kết quả thử nghiệm liên phòng đối với narasin
Thông số

1

2

3

4

5

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi
đã loại trừ ngoại tệ

10

10

10

8

9

Hàm lượng narasin trung bình,
mg/kg

66,2

41,6

76300

3,9

4,1

Độ lệch chuẩn lặp lại (sr), mg/kg

2,96

1,44

-

0,050

0,205

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %

4,46

3,45

-

1,27

5,00

Giới hạn lặp lại (r), % của hàm lượng
trung bình

12,5

9,66

-

3,59

14,0

Độ lệch chuẩn tái lập (sR), mg/kg

4,33

1,91

9615a

0,341

0,416

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

6,54

4,59

12,6a

8,69

10,1

Giới hạn tái lập (R), % của hàm
lượng trung bình

18,3

12,9

35,3a

24,5

28,5

Giá trị Horrat

0,77

0,50

4,28a

0,67

0,78

Thử nghiệm mẫu bổ sung thuốc thú y:

Thử nghiệm mẫu dạng vết:

Mẫu 1: thức ăn cho gà giò

Mẫu 4: thức ăn cho bò/vanilin

Mẫu 2: thức ăn cho lợn có nicarbazin

Mẫu 5: thức ăn cho bò/DMAB

Mẫu 3: Maxiban (mẫu đậm đặc có thuốc)


a

Số liệu độ lệch chuẩn và các thông số liên quan được báo cáo lại vì thiếu số liệu lặp lại hai lần
trong mỗi phòng thử nghiệm (các kết quả thử nghiệm được cung cấp dưới dạng mẫu đơn).
Bảng A.3 – Các kết quả thử nghiệm liên phòng đối với salinomycin
Thông số

1

2

3

4

5

6

7

8

8

10

10

10

10

10

10

10

Hàm lượng salinomycin
trung bình, mg/kg

68,4

22,2

34,6

626

1000

145000

4,5

4,5

Độ lệch chuẩn lặp lại
(sr), mg/kg

1,69

0,957

1,04

-

34,6

-

0,084

0,059

Độ lệch chuẩn tương đối
lặp lại, %

2,47

4,31

3,00

-

3,45

-

1,86

1,32

Giới hạn lặp lại (r), %
của hàm lượng trung
bình

6,91

12,1

8,38

-

9,68

-

5,20

3,69

Độ lệch chuẩn tái lập
(sR), mg/kg

1,82

1,26

1,52

26,6a

55,4

54880a

0,292

0,233

Độ lệch chuẩn tương đối
tái lập, %

2,67

5,67

4,39

4,24a

5,52

37,7a

6,47

5,20

Giới hạn tái lập (R), %
của hàm lượng trung
bình

7,47

15,9

12,3

11,9a

15,5

104a

18,2

14,5

Giá trị Horrat

0,31

0,57

0,47

0,70a

0,98

14,1a

0,51

0,41

Số phòng thử nghiệm
còn lại sau khi đã loại
trừ ngoại tệ

Thử nghiệm mẫu bổ sung thuốc thú y:

Thử nghiệm mẫu dạng vết:

Mẫu 1: thức ăn cho gà giò giai đoạn đầu

Mẫu 7: thức ăn cho bò sữa /valinin

Mẫu 2: thức ăn cho lợn thịt giai đoạn sau cai sữa

Mẫu 8: thức ăn cho bò sữa /DMAB

Mẫu 3: thức ăn cho bò thịt giai đoạn vỗ béo
Mẫu 4: thức ăn bổ sung cho bò (premix khoáng)
Mẫu 5: thức ăn bổ sung cho gà thịt (premix khoáng)
Mẫu 6: Bio-Cox (premix thuốc)
a

Số liệu độ lệch chuẩn và các thông số liên quan được báo cáo lại vì thiếu số liệu lặp lại hai lần
trong mỗi phòng thử nghiệm (các kết quả thử nghiệm được cung cấp dưới dạng mẫu đơn).
A.3. Ví dụ sắc kí
Ví dụ về sắc kí đối với hỗn hợp chuẩn D của HPLC được mô tả ở Hình A.1.


CHÚ DẪN
X: Thời gian lưu, min
Y: Chiều cao của pic, mV hoặc mAU
Nồng độ:
monesin:

4,85 μg/ml

salinomycin:

10,65 μg/ml

narasin:

8,98 μg/ml

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] LAPOINTE, M.R. and COHEN, H. J. AOAC, 71, 1988, pp. 480-484
[2] GORAS, J.T and LACOURSE, W.R. J. AOAC, 67, 1984, pp. 701-706
[3] BLANCHFOWER, W.J. et al. Analyst, 110, 1985, pp. 1283-1287
[4] RODEWALD, J.M., MORAN, J.W., DONOHO, A.L., COLEMAN, M.R.J. AOAC, 75, 1992, pp.
272-279
[5] RODEWALD, J.M., MORAN, J.W., DONOHO, A.L., COLEMAN, M.R.J. AOAC, 77, 1994, pp.
821-828
[6] AKHTAR, M.H and CROTEAU, L.G. Analyst, 121, 1996, pp. 803-806.
[7] COLEMAN, M.R., MACY, T.D., MORAN, J.W., RODEWALD, J.M. J.AOAC, 77, 1994, pp.
1065-1072
[7] COLEMAN, M.R., MORAN, J.W., MOWREY, D.H. J. AOAC Int, 80, 1997, pp. 693-702.
[9] Collaborative Study Guidelines, J. AOAC Int, 78, 1995, pp. 143A-160A.
[10] Appendix D: Guidelines for Collaborative Study procedures to validate characteristics of a
method of analysis, Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th edn, 2000
[11] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002),Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×