Tải bản đầy đủ

Phân loại và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018

PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
TỪ MÔ DÂY RỐN
Lê Thị Bích Phượng*; Đỗ Minh Trung**; Lê Văn Đông**
Đỗ Quyết**; Đồng Khắc Hưng**
TÓM TẮT
Mục tiêu: phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn. Đối tượng và phương
pháp: mẫu dây rốn (n = 5) thu nhận tại Khoa Sản, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh, được xử lý cắt
2
thành những mảnh mô nhỏ kích thước khoảng 2 mm và nuôi cấy trong môi trường chuyên biệt
để phân lập tế bào. Tế bào sau khi phân lập nuôi cấy tăng sinh được kiểm tra tính gốc thông
qua các chỉ tiêu như khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy, biểu hiện các dấu ấn bề
mặt cho dòng tế bào gốc trung mô trong giai đoạn nuôi cấy. Đánh giá tính an toàn của quá trình
phân lập qua kết quả kiểm tra nhiễm sắc thể đồ, nội độc tố và mycoplasma. Kết quả: phân lập
và nuôi cấy được tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn, tế bào thu nhận được có khả năng bám
dính vào bề mặt bình nuôi cấy, tế bào có dạng thuôn dài, giống với nguyên bào sợi, biểu hiện
dương tính với các dấu ấn CD44, CD73, CD90 (> 95%) và âm tính với các dấu ấn CD14,
CD45, HLADR (< 5%). Kết quả đánh giá tính an toàn của mẫu tế bào MSC phân lập được,
kết quả âm tính với nội độc tố và mycoplasma. Kết luận: đã phân lập và nuôi cấy được tế bào
gốc trung mô từ mô dây rốn, tế bào đạt các tiêu chí của tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn và

đảm bảo tính an toàn để ứng dụng trong điều trị lâm sàng.
* Từ khóa: Tế bào gốc trung mô; Mô dây rốn; Phân lập tế bào gốc trung mô.

Isolation and Culture of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical
Cord Tissues
Summary
Objectives: To isolate and culture umbilical cord tissue mesenchymal stem cells. Subjects
and method: Using human umbilical cords (n = 5) for isolated mesenchymal stem cells were
collected from the Obstetrics Department, Vanhanh General Hospital. After harvested, cords
2
were segmented into small pieces about 2 mm in size, cultured in a specialized medium for
isolation of mesenchymal stem cells. These stem cells were tested stemness based on criteria
such as their ability to stick on the surface of culture flasks, expression of surface markers of
mesenchymal stem cell lines during the culturing period. Safety evaluation was investigated by
examining karyotype, and the presence of endotoxin, mycoplasma. Results: Umbilical cord mesenchymal stem cells samples were successfully solated and cultured. The obtained
cells have ability to attach to the surface of culture flasks and having fibroblast-like shape.
* Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh
** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 10/03/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/05/2018
Ngày bài báo được đăng: 25/06/2018

22


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
These cells were positive with markers: CD44, CD73, CD90 (> 95%) and negative with marker
CD14, CD45, HLADR and passed the safety test with endotoxicity and mycoplasma.
Conclusions: We were successful in isolation, expansion of umbilical cord - mesenchymal stem
cells. The cell population met the criteria of UC-MSC and ensure safety for use in treatment.
* Keywords: Mesenchymal stem cell; Umbilical cord tissue; Isolation of mesenchymal
stem cells.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tế bào gốc trung mô (TBGTM) là một
nguồn tế bào gốc được sử dụng phổ biến
trong liệu pháp tế bào và liệu pháp gen [1].
Tương tự các kiểu tế bào gốc khác,
TBGTM là nhóm tế bào gốc đa tiềm năng,
có khả năng tự làm mới cao. TBGTM có


thể biệt hóa in vitro hay in vivo thành cả
hai dòng tế bào thuộc và không thuộc
trung mô.

TBGTM ngày càng được ứng dụng rộng
rãi trong các thử nghiệm lâm sàng điều trị
bệnh về miễn dịch và thoái hóa như bệnh
mô ghép chống túc chủ (Graft versus host
disease - GVHD), bệnh Crohn, bệnh tiểu
đường, suy thận, bệnh lý thần kinh như
chấn thương tủy sống... [5, 6] và gần đây
là trong nghiên cứu về liệu pháp gen đích
trong điều trị ung thư [7]. Kết quả thử nghiệm
khả quan về tính an toàn và hiệu quả
của liệu pháp điều trị, đặc biệt không ghi
nhận tác dụng phụ lâu dài hay hình thành
khối u hoặc loại thải tế bào trong quá trình
điều trị thử nghiệm [8].

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy,
dây rốn người là nguồn giàu TBGTM [2].
So với các nguồn khác, mẫu dây rốn có
các ưu điểm: thu nhận mẫu dây rốn
tương đối dễ dàng, không gặp phải các
rào cản về vấn đề đạo đức y khoa như
trường hợp thu nhận tế bào gốc phôi;
không gây xâm lấn, không ảnh hưởng tới
cả sản phụ và trẻ sơ sinh; số lượng tế
bào nhiều hơn và đặc điểm tự làm mới
cũng nhanh hơn [2, 3] và có thể sử dụng
cả nguồn dây rốn sẵn có từ việc lưu trữ
tại các ngân hàng tế bào gốc.

Với những kết quả đã được thử nghiệm
cùng với nhu cầu điều trị hiện nay,
TBGTM từ mô dây rốn thật sự là một giải
pháp an toàn, tiện lợi, kịp thời cho bệnh
nhân (BN) mắc bệnh hiểm nghèo và
không đủ điều kiện thu nhận tế bào tự
thân cho lộ trình điều trị bằng tế bào gốc.
Đảm bảo tiết kiệm thời gian và giảm thiểu
nguy cơ gây xâm lấn tới sức khỏe, tinh thần
BN trong thời gian điều trị.

Với những đặc tính ưu việt như trên,
cùng tính sinh miễn dịch thấp, biểu hiện
thấp HLA lớp I và không biểu hiện HLA
lớp II nên TBGTM là một giải pháp hữu
hiệu cho liệu pháp điều trị ghép tế bào
gốc đồng loài [4].

Xuất phát từ những vấn đề trên,
nghiên cứu đã: Tiến hành phân lập và
nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô dây rốn
tại Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh nhằm
tạo nguồn tế bào phục vụ cho nghiên cứu
và ứng dụng trong điều trị.
23


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu.
Mẫu dây rốn (n = 5) sử dụng cho phân
lập nuôi cấy TBGTM được thu nhận trong
điều kiện vô trùng tại Khoa Sản, Bệnh viện
Đa khoa Vạn Hạnh, thỏa mãn các điều
kiện: sản phụ < 30 tuổi, sinh con đủ tháng;
kết quả xét nghiệm âm tính với HIV, HAV,
HBV, HCV và giang mai; dây rốn trơn,
nhẵn, hồng.
Dây rốn sau khi thu nhận được đặt
trong dung dịch nước muối vô trùng (natri
clorid 0,9%), bảo quản ở điều kiện nhiệt
độ khoảng 40C và chuyển mẫu về phòng
thí nghiệm, thời gian lưu mẫu tối đa không
quá 72 giờ.
2. Phương pháp nghiên cứu.

5% C02. Theo dõi khả năng bám dính của
mẫu mô sau 24 giờ và 72 giờ trải mẫu.
Thay môi trường 3 ngày/lần. Đến khi tế
bào xuất hiện, mọc dày bao quanh mảnh
mô, tiến hành tách tế bào và chuyển qua
các bình nuôi mới để nuôi và tiếp tục nuôi
cấy mẫu mô trong bình nuôi chứa môi
trường MSC Cult Clinic completed mới.
* Nuôi cấy TBGTM:
Nuôi TBGTM trong môi trường MSC
Cult, thay môi trường 3 ngày/lần và tiến
hành cấy chuyền khi tế bào bám dính,
tăng sinh mật độ đạt khoảng 70 - 80%
diện tích bề mặt bình nuôi cấy. Tách tế bào
bằng enzym Detachment (RegenmedLab,
Việt Nam), ly tâm ở tốc độ 2.500 vòng/
5 phút. Tiến hành cấy chuyển tế bào với
tỷ lệ 1:2 hoặc 1:3, cấy chuyển TBGTM tới
lần cấy chuyển thứ 4.

* Nuôi cấy mô dây rốn phân lập tế
bào gốc:

* Đánh giá chất lượng quần thể tế bào
phân lập:

Mẫu mô được phân lập theo quy trình
chuyển giao từ Viện Tế bào gốc, Đại học
Khoa học Tự nhiên: tiến hành giải xoắn
dây rốn, cắt tại những chỗ xoắn thành
từng đoạn ngắn, xẻ dọc mỗi đoạn ngắn,
mở trải ra thành tấm, cạo lớp màng phía
trên, loại bỏ sạch mạch máu, cắt mẫu mô
thành các mảnh nhỏ có kích thước nhỏ
khoảng 2 mm2. Rửa mẫu mô trong nước
muối sinh lý vô trùng từ 2 - 3 lần, trải vào
bình nuôi (flasks 75 cm2). Bổ sung vào
bình nuôi 8 ml môi trường MSC Cult Clinic
completed (RegenmedLab, Việt Nam),
lắc nhẹ cho mẫu mô dàn đều mà không
cụm lại với nhau. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37ºC,

Tế bào được nuôi cấy và phân lập
theo quy trình tại Phòng Thí nghiệm Tế
bào gốc, Đơn vị Tế bào gốc Vạn Hạnh.
Chuyển mẫu kiểm tra, đánh giá chất lượng
độc lập tại Viện Tế bào gốc, Đại học
Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh.

24

* Xác định các dấu ấn của TBGTM:
Xác định dấu ấn của tế bào gốc thông
qua các kháng nguyên bề mặt tế bào, ở
lần cấy chuyển thứ 4 (P4), tế bào được
tách ra và nhuộm với panel kháng thể đơn
clon kháng CD44, CD73, CD90, CD14,
CD45, HLADR. Kết quả phân tích bằng
kỹ thuật flowcytometry trên hệ thống FACS
Calibur (Becton Dickinson).


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018

và trải tế bào trên lame kính. Quan sát và

enzym, chuyển ADP thành ATP. Dựa vào
đo ATP thông qua kết quả đo mật độ
quang với máy Luminometter có thể xác
định sự hiện diện hay vắng mặt của
mycoplasma.

chụp hình nhiễm sắc thể (NST), sắp xếp các

Sau khi đặt các vật liệu thí nghiệm về

bộ NST sử dụng phần mềm metasystem.

nhiệt độ phòng, ly tâm 2 ml dịch nuôi tế

NST đồ thực hiện trên lần cấy chuyển

bào ở 1.500 vòng/5 phút. Chuyển 100 µl

thứ 5, khi mật độ tế bào đạt gần 80%,

dịch huyền phù trong vào cuvetter máy

tiến hành thay môi trường mới và bắt đầu

Luminometter, thêm 100 µl dung dịch

kiểm tra NST.

MycoAlert reagent vào mỗi ống, đợi 5 phút,

* Kiểm tra nhiễm sắc thể đồ:
Tế bào được nuôi cấy và làm ngừng
phân bào tại pha metaphase bằng colcicin.
Sau đó, nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa

Nhuộm G-banding. Nhúng lần lượt mẫu

đọc kết quả Reading A bằng máy

lame trong trypsin 37ºC, PBS lạnh trong

Luminometter. Thêm 100 µl MycoAlert

10 giây, thuốc nhuộm Giemsa trong 4 phút.

substrate vào mỗi mẫu, đợi 10 phút,

Để mẫu lame 2 phút ở nhiệt độ phòng và

đọc kết quả Reading B. Xác định sự tồn

dùng bình tia rửa phần thuốc nhuộm thừa.

tại của mycoplasma qua tỷ số Reading

Xử lý tiêu bản bằng hệ thống IKAROS.

B/Reading A như sau:

* Kiểm tra nội độc tố bằng chế phẩm LAL:
Nội độc tố (endotoxin) được kiểm tra
bằng kỹ thuật tạo gel với Limulus Amebocyte
Lysate - LAL (Lonza) theo quy trình của
FDA (Mỹ). Trộn đều chế phẩm LAL với mẫu
tế bào cần kiểm tra. Sau thời gian ủ 60 phút,

+ Nếu B/A < 0,9: kết quả âm tính cho
mycoplasma.
+ Nếu B/A từ 0,9 - 1,2: lặp lại thí nghiệm
sau 24 giờ.
+ Nếu B/A > 1,2: kết quả nhiễm
mycoplasma (dương tính).

cẩn thận lấy từng ống mẫu thử, ghi lại
phản ứng trong mỗi ống. Mẫu dương tính
với nội độc tố sẽ tạo gel, còn mẫu âm tính
thì không.
* Kiểm tra mycoplasma:
Kiểm tra mycoplasma bằng phương pháp
đánh giá hoạt tính enzym đặc hiệu của
mycoplasma sử dụng bộ kít MycoAlert
mycoplasma detection, kít chứa các cơ
chất và chất giải phóng enzym ra khỏi
mycoplasma. Những cơ chất sẽ tác động

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
Kết quả nuôi cấy mô dây rốn phân lập
tế bào gốc: sau 24 giờ các mảnh mẫu mô
được nuôi cấy bắt đầu bám dính vào bề
mặt bình nuôi cấy, số lượng đạt khoảng
30 - 50%, sau 72 giờ các mẫu mô bám
dính hoàn toàn vào bề mặt bình nuôi cấy
và sau 5 - 7 ngày, các tế bào di cư xuất
hiện ra tại rìa mảnh mô (hình 1A).
25


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018

A

B

C

D

Hình 1: Sự di cư của TBGTM từ mẫu mô dây rốn trong thời gian nuôi cấy 5 - 21 ngày.
(Hình 1A: Sau 7 ngày nuôi; hình 1B: Sau 10 ngày nuôi;
hình 1C: Sau 14 ngày nuôi; hình 1D: Tế bào P1 sau 4 ngày cấy chuyển)
TBGTM thu được từ mẫu mô dây rốn có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ
nuôi cấy, dạng thuôn dài gần giống với hình dạng của nguyên bào sợi (hình 1D).
Sau 14 - 21 ngày, tế bào trong bình mô nuôi cấy trải đều, mật độ đạt khoảng 70%,
đây là thời điểm có thể tiến hành đợt cấy chuyền đầu tiên (P0 cấy ra P1) (hình 1B-C).
Bảng 1: Kết quả kiểm tra các marker của TBGTM từ mô dây rốn bằng flowcytometry.
Marker dương tính (%)

Mẫu TBGTM
từ mô dây rốn

26

Marker âm tính (%)

CD44

CD73

CD90

CD14

CD45

HLADR

Mẫu 1

95,64

97,50

98,57

5,98

3,80

0,24

Mẫu 2

99,94

99,74

99,86

0,73

0,06

0,01

Mẫu 3

99,94

98,21

99,77

0,72

0,26

0

Mẫu 4

99,64

96,65

98,02

4,81

0,38

0,51

Mẫu 5

99,7

99,37

99,63

3,04

4,33

0,64


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018

0.73 %
0.06 %

99.94

0.01 %

99.74
99.86

Hình 2: Khảo sát các dấu ấn của TBGTM từ mô dây rốn bằng flowcytometry (mẫu 2).
Về biểu hiện dấu ấn của TBGTM, kết quả dương tính cao (> 95%) với các marker CD44,
CD73, CD90 và âm tính với các marker CD14, CD45, HLADR (< 5%) ở cả 5 mẫu dây
rốn khảo sát (bảng 1, hình 2). Đây là một kết quả khả quan về hiệu quả phân lập TBGTM
từ mô dây rốn theo tiêu chuẩn định danh TBGTM theo kiểu hình miễn dịch tế bào.
Theo kết quả công bố của Hội Liệu pháp tế bào quốc tế, TBGTM từ mô dây rốn vẫn
giữ được tính gốc tính tới lần cấy chuyển thứ 15. Tuy nhiên, trong nghiên cứu gần đây
của De Witte S.F và CS (2017) khảo sát về tính ổn định của kiểu hình và chức năng
của TBGTM qua các giai đoạn cấy chuyền lần thứ 4, lần thứ 8 và lần thứ 12 cho thấy,
không có sự thay đổi đáng kể về kiểu hình miễn dịch TBGTM nhưng khả năng điều
biến miễn dịch, định hướng tế bào T cảm ứng biệt hóa thành tế bào TCD4+ và TCD8+
suy giảm [5]. Vì vậy, để đảm bảo chất lượng TBGTM ổn định về hình thái, chức năng
cảm ứng và điều biến miễn dịch, tế bào sử dụng cho ứng dụng thử nghiệm lâm sàng,
nghiên cứu của chúng tôi dự kiến giới hạn sử dụng tế bào ở lần cấy chuyển thứ 4.
Từ đó các mẫu TBGTM được kiểm tra tính ổn định ở lần cấy chuyển thứ 5 tiếp đó.
Kết quả cho thấy, không có biến động về số lượng NST của tế bào (2n = 46) sau 5 lần
cấy chuyển liên tiếp ở tất cả các mẫu tế bào được phân lập và nuôi cấy.
Bên cạnh đó còn đánh giá tính an toàn của việc nuôi cấy TBGTM mô dây rốn qua
kết quả kiểm tra nội độc tố và mycoplasma. Vì đây là 2 tác nhân có ảnh hưởng trực
tiếp đến chất lượng điều trị và có khả năng biến động trong quá trình nuôi cấy. Kết quả
các mẫu TBGTM từ mô dây rốn (n = 5) phân lập được trong quá trình nuôi cấy:
không có mẫu nào nhiễm nội độc tố và mycoplasma.
27


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
Bảng 2: Kết quả kiểm tra nội độc tố bằng chế phẩm LAL.
Mẫu TBGTM
Kết quả

Mẫu 1

Mẫu 2

Mẫu 3

Mẫu 4

Mẫu 5

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Bảng 3: Kết quả kiểm tra mycoplasma.
Mẫu TBGTM

Tỷ số B/A

Kết quả

Mẫu 1

0,75692

Không nhiễm mycoplasma

Mẫu 2

0,2

Không nhiễm mycoplasma

Mẫu 3

0.77747

Không nhiễm mycoplasma

Mẫu 4

0.15242

Không nhiễm mycoplasma

Mẫu 5

0.15929

Không nhiễm mycoplasma

Kiểm tra nội độc tố bằng chế phẩm LAL từ 5 mẫu TBGTM dây rốn đều cho kết quả
âm tính, không có sự tạo gel từ các mẫu kiểm (bảng 2). Kiểm tra mycoplasma cũng
cho kết quả tất cả các mẫu đều âm tính (bảng 3). Đây là hai thông số quan trọng xác
định tính an toàn của sản phẩm tế bào sử dụng cho BN trong điều trị lâm sàng hiện
nay theo tiêu chuẩn của FDA (Mỹ). Kết quả này cho thấy quy trình phân lập và nuôi
cấy TBGTM từ mô dây rốn của chúng tôi hoàn toàn phù hợp. Tế bào gốc phân lập và
nuôi cấy được đạt tiêu chuẩn để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng liệu pháp tế bào
trong thử nghiệm và điều trị lâm sàng. Kết quả này mở ra một hướng đi mới về tiềm
năng ứng dụng của TBGTM từ mô dây rốn trong điều trị lâm sàng.
KẾT LUẬN
Đã phân lập và nuôi cấy được TBGTM
từ mô dây rốn, các tế bào có khả năng
bám dính, có hình dạng giống nguyên bào
sợi, biểu hiện dương tính (> 95%) với các
dấu ấn của TBGTM CD44, CD73, CD90,
ổn định về bộ NST, tế bào đảm bảo tính
an toàn không nhiễm nội độc tố, mycoplasma,
đạt yêu cầu để sử dụng cho nghiên cứu
và ứng dụng trong điều trị lâm sàng.
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài
mã số KC.10.15/16-20. Nhóm tác giả trân
trọng cảm ơn những người đã tình nguyện
28

tham gia nghiên cứu, Học viện Quân y,
Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh và Viện Tế
bào gốc đã ủng hộ, tạo điều kiện và tích
cực hợp tác trong quá trình nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Caplan A.I, S.P Bruder. Mesenchymal
stem cells: Building blocks for molecular medicine
in the 21st century. Trends in Molecular Medicine.
2001, 7 (6), pp.259-264.
2. Romanov Y.A, V.A Svintsitskaya, V.N
Smirnov. Searching for alternative sources of
postnatal human mesenchymal stem cells:
Candidate MSC-like cells from umbilical cord.
Stem Cells. 2003, 21 (1), pp.105-110.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
3. Dalous J, J Larghero, O Baud.
Transplantation of umbilical cord-derived
mesenchymal stem cells as a novel strategy
to protect the central nervous system:
Technical aspects, preclinical studies and
clinical perspectives. Pediatric Research.
2012, 71 (4-2), p.482.
4. Gnecchi M, L.G Melo. Bone marrowderived mesenchymal stem cells: Isolation,
expansion, characterization, viral transduction
and production of conditioned medium, in Stem
Cells in Regenerative Medicine. Springer. 2009,
pp.281-294.
5. De Witte S.F et al. Aging of bone
marrow-and umbilical cord-derived mesenchymal

stromal cells during expansion. Cytotherapy.
2017, 19 (7), pp.798-807.
6. Squillaro T, G Peluso, U Galderisi.
Clinical trials with mesenchymal stem cells:
An update. Cell Transplantation. 2016, 25 (5),
pp.829-848.
7.

Marofi

F

et

al.

Mesenchymal

stromal/stem cells: A new era in the cell-based
targeted gene therapy of cancer. Frontiers in
Immunology. 2017, p.8.
8. Can A, F.T Celikkan, O Cinar. Umbilical
cord mesenchymal stromal cell transplantations:
A systemic analysis of clinical trials. Cytotherapy.
2017, 19 (12), pp.1351-1382.

29



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×