Tải bản đầy đủ

Biến đổi mới của một số gen ty thể mã hóa cho tRNA ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng người Việt Nam

VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 35, No. … (2019) 1-6

Original article

Novel Alterations of Some Mitochondrial tRNA Genes
in Vienamese Colorectal Cancer Patients
Pham Thi Bich1, Nguyen Thi Van1, Ta Van To2, Trinh Hong Thai1,*
1

Faculty of Biology, VNU University of Science
Department of Anatomical Pathology - Cytopatology, Vietnam National Cancer Hospital

2

Received 14 January 2019
Revised 13 March 2019; Accepted 15 March 2019

Abstract: Some mutations of mt-DNA which encode tRNA (mt-tRNA) were previously reported
to be associated with clinical manifestations of neuromuscular disorders syndrome. In addition,
alterations of the mitochondrial genome have been suggested to contribute to mitochondrial
dysfunction and tumorigenesis. Alterations in some mt-tRNA genes have also been identified in

breast cancer, lung cancer and colorectal cancer. However, so far, we have not found any report on
mt-tRNA gene alteration in the Vietnamese colorectal cancer patients. So that, in this study, we
analyzed the alterations of some mt-tRNA genes in a group of Vietnamese colorectal cancer
patients and predicted influence of the alterations to secondary structure of tRNA based on
bioinformatic tools. PCR-RFLP and DNA sequencing methods were used to screening alterations,
secondary structure of tRNA was predicted in silico by using a tool of the Vienna RNA Websuite.
Results: both A12309G and A12310G of tRNALeu were identified together in two out of 98
patients, and both T12150G and C12154G of tRNAHis were indentified in one out of 19 patients.
All of these alterations were heteroplasmic and have not been reported in cancer patients. In
particular, the C12154G alteration in the DHR loop led to change of secondary structure of
tRNAHis and may affect to function of this tRNA molecule.
Keywords: mt-tRNA, Vietnamese colorectal cancer, PCR-RFLP, DNA sequencing.
*

________


Corresponding author.
Email address: thaith@vnu.edu.vn
https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4856

1


VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 35, No. … (2019) 1-6

Biến đổi mới của một số gen ty thể mã hóa cho tRNA ở bệnh
nhân ung thư đại trực tràng người Việt Nam
Phạm Thị Bích1, Nguyễn Thị Vân1, Tạ Văn Tờ2, Trịnh Hồng Thái1,*
1

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN,
2
Khoa Giải phẫu bệnh -Tế bào, Bệnh viện K, Hà Nội

Nhận ngày 14 tháng 1 năm 2019
Chỉnh sửa ngày 13 tháng 03 năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 15 tháng 03 năm 2019

Tóm tắt: Một số đột biến ADN ty thể mã hóa cho phân tử tRNA (mitochondrial tRNA: mt-tRNA)
đã được xác định có liên quan đến biểu hiện lâm sàng và thường gây ra các hội chứng liên quan


đến các bệnh về cơ và thần kinh. Bên cạnh đó, những thay đổi trong hệ gen ty thể dẫn đến rối loạn
chức năng ty thể từ lâu đã được giả thiết góp phần vào sự phát sinh khối u. Ở ung thư vú, ung thư
phổi, ung thư đại trực tràng (UTĐTT), biến đổi của gen mt-tRNA cũng đã được xác định, tuy
nhiên, chúng tôi chưa tìm thấy nghiên cứu nào trên đối tượng UTĐTT người Việt Nam. Vì vậy,
trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc biến đổi của một số gen mt-tRNA ở một
nhóm bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam và dự đoán ảnh hưởng của một số vị trí biến đổi tìm
được đến cấu trúc bậc hai của tRNA. Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP, giải trình tự ADN để sàng lọc
biến đổi và phương pháp mô hình hóa phân tử RNA để dự đoán sự thay đổi cấu trúc bậc hai của
chúng. Kết quả chúng tôi đã xác định thấy 2 trên 98 bệnh nhân có đồng thời hai biến đổi A12309G
và A12310G thuộc tRNALeu, 1 trên 19 bệnh nhân có đồng thời hai biến đổi T12150G và C12154G
thuộc tRNAHis. Các biến đổi nêu trên đều ở dạng dị tế bào chất và đều chưa được công bố trên đối
tượng bệnh nhân ung thư. Đặc biệt, biến đổi C12154G thuộc vùng DHU của tRNAHis được dự đoán
làm thay đổi cấu trúc bậc hai của phân tử và có thể ảnh hưởng đến chức năng của phân tử tRNA.
Từ khóa: Biến đổi của gen mt-tRNA, UTĐTT người Việt Nam, PCR-RFLP, giải trình tự ADN.

1. Mở đầu

rối loạn ADN ty thể được xem là một yếu tố
nguy cơ 2 . Trong đó, mối liên quan giữa biến
đổi của các gen tRNA với ung thư ngày càng
được quan tâm. Ở ung thư gan, một số dạng
biến đổi đã được xác định bao gồm biến đổi
T1659C thuộc gen tRNAVal, G5650A thuộc gen
tRNAAla, T10463C thuộc gen tRNAArg,
A14679G thuộc gen tRNAGlu và C15975T
thuộc gen tRNAPro 3 ; biến đổi A12308G thuộc
gen tRNALeu được tìm thấy ở UTĐTT 4 và
bệnh ung thư miệng 5 . Ngoài ra, biến đổi

Hiện nay, t lệ m c mới và tử vong do
UTĐTT vẫn đang ở mức cao trên thế giới và ở
Việt Nam, điều đó cho thấy đây là căn bệnh
nguy hiểm và vẫn đang là gánh nặng toàn cầu
1 . Trong các yếu tố liên quan đến ung thư thì
________


Tác giả liên hệ.
Địa chỉ email: thaith@vnu.edu.vn
https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4856

2


T T.H. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 35, No. …. (2019) 1-6

A7460G thuộc gen tRNASer, G5563A thuộc gen
tRNATrp và A12172G thuộc gen tRNAHis được
xác định ở ung thư phổi 6 . Tuy nhiên, việc
sàng lọc đột biến trên mt-tRAN vẫn chưa được
thực hiện ở UTĐTT người Việt Nam. Vì vậy,
nghiên cứu biến đổi của tRNA ở UTĐTT và
ảnh hưởng của một số biến đổi tìm được đến
cấu trúc hoặc chức năng của phân tử tRNA là
cần thiết.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng
phương pháp PCR-RFLP, giải trình tự để sàng
lọc biến đổi của các gen mt-tRNA và dùng
phương pháp mô hình hóa phân tử RNA in
silico 7 để mô hình hóa phân tử RNA và dự
đoán sự thay đổi cấu trúc của RNA tại một số vị
trí biến đổi xác định được.
2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1. Nguyên liệu
Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân
UTĐTT được lấy tại vị trí khối u và vị trí lân
cận khối u (cách khối u tối thiểu 5cm, diện c t
được xác định không còn tế bào ung thư). Mẫu
nghiên cứu cùng với các thông tin của bệnh

3

nhân như độ tuổi, giới tính, vị trí, kích thước u,
độ biệt hóa và giai đoạn bệnh do Khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, bệnh viện K cung cấp. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi đã tập trung sàng lọc
đột biến A3243G trên 30 cặp mẫu, đột biến
G12300A trên 68 cặp mẫu, đột biến A12308G
trên 98 cặp mẫu và giải trình tự ADN để sàng
lọc các biến đổi khác của các gen mã hóa cho
một số tRNA trên19 mẫu.
2.2. Phương pháp
Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng số từ
mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT được tách chiết
b ng kit QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN,
Đức). Kit tách chiết này đảm bảo việc tách
được cả ADN ty thể. Các bước được tiến hành
theo quy trình của nhà sản xuất. ADN sau khi
tách chiết được xác định nồng độ và độ sạch
b ng máy quang phổ Nano drop 2000c
(Thermo, Mỹ) và bảo quản ở -200C.
Phương pháp PCR-RFLP: Các đoạn gen
mt-tRNA chứa các vị trí 3243, 12300, 12308
được khuếch đại b ng phản ứng PCR với các
cặp mồi đặc hiệu được thiết kế b ng phần mềm
Primer-BLAST trong NCBI. Trình tự các cặp
mồi sử dụng cho nghiên cứu được trình bày
trong Bảng 1.

Bảng 1. Các cặp mồi được dùng trong phản ứng PCR-RFLP
Tên
mồi

Trình tự mồi
F

3243

12300

7375

11718

5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’

R

5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’

F

5’-CTGACAACAGAGGCTTACGA-3’

R

5’-AACTTCTTGGTCTAGGCACAT-3’

F

5’-ATGAGGAATAGTGTAAGGAGTA-3’

R

5’-ACCTGGAGTGACTATATGGAT-3’

F

5’-AACTTCTTGGTCTAGGCACAT-3’

R

Kích thước sản
phẩm PCR (bp)

Mục đích

218

Nhân đoạn ADN
chứa vị trí 3243

346

Nhân đoạn ADN
chứa vị trí 12300 và
12308

1059

Nhân đoạn ADN
dùng cho giải trình
tự trực tiếp

801

5’-GGCTTACATCCTCATTACTATTCT-3’

Phản ứng PCR gồm các thành phần: 6,25 l
OneTaq Hot Start 2x Master Mix (Neb, Mỹ);

0,2 M mồi gồm mồi xuôi và mồi ngược, 12,531 ng ADN khuôn, sau đó bổ sung H2O đến


4

T.H. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 35, No. …. (2019) 1-6

12,5 l. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm
biến tính ở 940C trong 30 giây, g n mồi ở 540C
trong 30 giây và kéo dài mạch ở 680C trong 30
giây, thực hiện phản ứng PCR với 35 chu kỳ.
Dựa trên trình tự của sản phẩm PCR được nhân

bản theo các cặp mồi thiết kế, chúng tôi đã lựa
chọn được các enzyme giới hạn phù hợp để
phát hiện biến đổi b ng RFLP, trình tự nhận
biết của các enzyme dùng trong nghiên cứu
được trình bày ở Bảng 2:

Bảng 2. Các enzyme được sử dụng trong nghiên cứu
Loại đột biến

Loại
RE

Trình tự nhận biết

A3243G
G12300A

HaeIII

5'...GG↓C C ...3'

A12308G/A12309G

ApoI

5’ ... R↓AATTY...3’
(R: A/G) (Y: C/T)

Sản phẩm PCR và sản phẩm c t b ng
enzyme được điện di kiểm tra trên gel agarose
2 , nhuộm ethidium bromide hoặc gen
polyacrylamide nhuộm bạc. Quan sát và chụp
ảnh bản gel b ng hệ thống máy Gel Doc TM
XR (Biorad).
Giải trình tự ADN: Bên cạnh sử dụng
phương pháp PCR-RFLP để xác định các đột
biến quan tâm, chúng tôi còn sử dụng phương
pháp giải trình tự ADN để sàng lọc các đột biến
khác của các gen mt-tRNA. Hai cặp mồi ký
hiệu là 7375 và 11718 (trình tự ở Bảng 1) nhân
lên các đoạn ADN có kích thước lần lượt là
1059 bp và 801 bp chứa các gen mã hóa cho
tRNASer có vị trí: 7446-7514, tRNAAsp: 75187585, tRNALys: 8295-8364 và tRNAHis: 1213812206, tRNASer: 12207-12265, tRNALeu:
1226612336. Đoạn ADN được giải trình tự thông
qua công ty thương mại (công ty the 1st
BASE). Phần mềm Bioedit được dùng để phân
tích kết quả giải trình tự. Kết quả giải trình tự
được so sánh với trình tự ADN ty thể tham
chiếu trên NCBI mã số NC_012920.1 b ng
chương trình BLAST nucleotide trên NCBI 8
để xác định biến đổi.
Mô hình hóa phân tử RNA: Sử dụng
chương trình RNAfold Server trong The Vienna
RNA Websuite để dự đoán cấu trúc của
RNA [7].

Kích thước sản phẩm c t (bp)
ADN không bị đột
ADN đột biến
biến
22, 27, 169
22, 27, 72 và 97
128 và 218
346
346

135 và 211

Như vậy, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc
biến đổi ở một số vị trí 3243, 12300, 12308 và
12309 thuộc gen ty thể mã hóa cho tRNALeu
trên mẫu mô của một nhóm bệnh nhân UTĐTT.
Tuy nhiên, tần suất của các biến đổi rất thấp. Vì
vậy, chúng tôi đã thiết kế hai cặp mồi 7375 và
11718 để nhân các đoạn ADN dài 1059 bp và
801 bp tương ứng chứa các gen mã hóa cho
tRNASer vị trí: 7446-7514, tRNAAsp: 7518-7585,
tRNALys: 8295-8364 và tRNAHis: 12138-12206,
tRNASer: 12207-12265, tRNALeu: 12266-12336,
tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự ADN
để xác định các biến đổi.
Kết quả phân tích trình tự đoạn ADN được
nhân lên b ng cặp mồi 7375 từ 19 mẫu mô ung
thư, không có mẫu nào xuất hiện biến đổi ở
vùng mã cho tRNA được nghiên cứu (Hình
2A). Trong khi đó, với đoạn ADN được nhân
lên từ cặp mồi 11718 xác định thấy hai biến đổi
đáng quan tâm là tại vị trí 12150 biến đổi T
thành G và vị trí 12154 biến đổi C thành G. Đặc
biệt, biến đổi ở hai vị này đều ở dạng dị tế bào
chất, cùng xuất hiện ở trong một mẫu nghiên
cứu và đều thuộc gen tRNAHis (Hình 2B). Tra
cứu trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen ty thể
Mitomap chúng tôi chưa thấy có công bố nào
liên quan đến hai biến đổi T12150G và
C12154G. Vì vậy, đây là những biến đổi mới
được phát hiện ở bệnh nhân UTĐTT người
Việt Nam.


T T.H. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 35, No. …. (2019) 1-6

Sử dụng chương trình RNAfold Server
trong The Vienna RNA Websuite 7 để dự
đoán cấu trúc bậc hai của phân tử tRNAHis, kết
quả dự đoán cho thấy biến đổi T12150G không
dẫn đến thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử
tRNAHis (Hình 3B). Trong khi đó, biến đổi
C12154G làm thay đổi cấu trúc bậc hai của
phân tử (Hình 3C), đặc biệt khi xảy ra đồng thời
cả hai biến đổi T12150G và C12154G (Hình
3D). Phần mềm đã cho phép xác định sự thay
đổi năng lượng tự do tối thiểu (minimum free
energy - MFE) của phân tử tRNA khi có biến
đổi. Cụ thể, biến đổi của tRNAHis dẫn đến làm
tăng năng lượng tự do tối thiểu từ -10,4
kcal/mol (dạng không biến đổi) lên -8,9
kcal/mol (khi có biến đổi C12154G) và -9,3
kcal/mol (khi có đồng thời hai biến đổi
T12150G và C12154G). Sự thay đổi về cấu trúc
và sự tăng năng lượng tự do tối thiểu của tRNA
có thể dẫn đến giảm độ bền của phân tử nên có
thể ảnh hưởng đến chức năng của phân tử
tRNA.
Đột biến gen mt-RNA đang ngày càng được
công nhận là nhân tố quan trọng liên quan đến
sự phát sinh một số bệnh trong đó có ung thư
10 . Các đột biến điểm trên tRNA có thể dẫn
đến khiếm khuyết trong quá trình phiên mã,
dịch mã, rối loạn chức năng chuỗi hô hấp ty thể
và từ đó có thể liên quan đến đặc điểm lâm sàng
của một số bệnh. Ở ung thư phổi, Wang và cs
đã chỉ ra một số biến đổi trên gen tRNA có thể
dẫn đến thay đổi cấu trúc của tRNA, do đó có
thể làm giảm hiệu quả của sự nhận biết giữa
codon - anticodon và quá trình mã hóa axit
amin, điều đó có thể dẫn đến lượng ATP sản
xuất dưới ngưỡng yêu cầu cho chức năng tế bào
bình thường và góp phần phát sinh ung thư. Cụ
thể, đột biến A12172G làm thay đổi cấu trúc và
năng lượng tự do tối thiểu của tRNAHis và được
xác định có vai trò quan trọng đối với ung thư
phổi 6 . Trong nghiên cứu này chúng tôi đã
sàng lọc thấy biến đổi C12154G và T12150G
của tRNAHis ở bệnh nhân UTĐTT và b ng
phương pháp mô hình hóa cấu trúc bậc hai của
RNA cũng nhận thấy biến đổi C12154G làm
thay đổi cấu trúc bậc hai và tăng năng lượng tự
do tối thiểu của phân tử tRNAHis, đặc biệt nếu

5

có sự tồn tại đồng thời của hai biến đổi
C12154G và T12150G (Hình 3C và 3D). Trong
cấu trúc của tRNA, đột biến gây bệnh thường
xảy ra tại vùng gốc sau đến vùng DHU 12], vì
vậy, biến đổi C12154G thuộc vòng DHU làm
thay đổi cấu trúc của tRNAHis có thể ảnh hưởng
đến chức năng của tRNAHis và từ đó có thể liên
quan đến sự phát sinh UTĐTT.
Hơn nữa, trong mỗi tế bào, số lượng bản
sao ADN ty thể dao động từ hàng trăm đến
hàng nghìn bản sao. Các bản sao có thể giống
nhau (dạng đồng tế bào chất, homoplasmy) hay
không giống nhau (dị tế bào chất,
heteroplasmy). Đa số các đột biến ADN ty thể
tồn tại ở dạng dị tế bào chất 6, 9, 13, 14 .
Tương đồng với các kết quả nghiên cứu trên,
trong nghiên này chúng tôi cũng đã xác định
thấy các biến đổi A12309G, A12310G,
T12150G và C12154G ở bệnh nhân UTĐTT
đều tồn tại ở trạng thái dị tế bào chất. Tuy
nhiên, ảnh hưởng của biến đổi đến biểu hiện
lâm sàng của bệnh còn phụ thuộc vào mức độ dị
tế bào chất của biến đổi. Vì vậy, việc nghiên
cứu định lượng được mức độ dị tế bào chất của
các biến đổi kể trên là cần thiết trong các
nghiên cứu tiếp theo.
Đặc biệt, cả bốn biến đổi A12309G,
A12310G, T12150G và C12154G được xác
định trong nghiên cứu này đều là các biến đổi
chưa từng được công bố trong các nghiên cứu
trước đây trên đối tượng bệnh nhân ung thư. Vì
vậy, đây có thể là những biến đổi mới của gen
mt-tRNA ở đối tượng UTĐTT mà chúng tôi đã
xác định được.
4. Kết luận
B ng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự
ADN, các biến đổi A12309G, A12310G thuộc
gen tRNALeu, C12154G và T12150G thuộc gen
tRNAHis đã được xác định ở mẫu mô UTĐTT
với tần suất tương ứng là 2,04 (với biến đổi
A12309G, A12310G) và 5,26 (với biến đổi
C12154G và T12150G). Cả bốn biến đổi nêu
trên đều ở trạng thái dị tế bào chất và là các
biến đổi mới chưa từng được công bố trên đối


6

T.H. Thai et al. / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 35, No. …. (2019) 1-6

tượng bệnh nhân ung thư. Đặc biệt, b ng
phương pháp mô hình hóa phân tử RNA bước
đầu nhận thấy biến đổi C12154G thuộc vùng
DHU của tRNAHis làm thay đổi cấu trúc bậc hai
của tRNAHis và làm tăng năng lượng tự do tối
thiểu của phân tử, vì vậy biến đổi này có thể sẽ
ảnh hưởng đến chức năng của tRNAHis và từ đó
có thể góp phần vào sự phát sinh UTĐTT. Tuy
nhiên, để đánh giá mối liên quan giữa các biến
đổi nêu trên với các đặc điểm bệnh học của
UTĐTT cũng như mối liên quan giữa mức độ
đột biến với mức độ biểu hiện của bệnh thì việc
tăng cỡ mẫu nghiên cứu và định lượng mức độ
dị tế bào chất của các biến đổi là cần thiết.
Lời cảm ơn
Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ
kinh phí của Đề tài cấp nhà nước KC.04.10/1115. Quy trình và các thủ tục lấy mẫu nghiên cứu
được sự giúp đỡ từ các bác sỹ, y tá của Bệnh
viện K - Hà Nội. Bệnh nhân tham gia nghiên
cứu tự nguyện.
Tài liệu tham khảo
[1] http://globocan.iarc.fr/Pages/online.aspx
(30/11/2017).
[2] M. Brandon, P. Baldi, D.C Wallace, Mitochodrial
mutations in cancer, Oncogen 25(34) (2006) 4647.
[3] G. Li, YX. Duan, XB. Zhang, F Wu, Mitochondrial
RNA mutations may be infrequent in
hepatocellular carcinoma patients, Genet Mol
Res15(2) (2016) doi: 10.4238/gmr.15027665.

[4] F. Mohammed, AR. Rezaee, E. Mosaieby, M.
Houshmand, Mitochondrial A12308G alteration in
RNA Leu (CUN)) in colorectal cancer samples,
Diagn Pathol (2015) doi: 10.1186/s13000-015-03376.
[5] S. Datta, M. Majumder, NK. Biswas, N. Sikdar, B.
Roy, Increased risk of oral cancer in relation to
common Indian mitochondrial polymorphisms and
Autosomal GSTP1 locus, Cancer, 110 (2007) 1999.
[6] L .Wang , ZJ. Chen , YK. Zhang , HB. Le, The role
of mitochondrial RNA mutations in lung cancer, Int
J Clin Exp Med 8(8) (2015) 13341.
[7] AR. Gruber, R. Lorenz, SH. Bernhart, R. Neubock,
IL Hofacker The Vienna ARN Websuite, Nucleic
Acids Res 36 (2008) 70.
[8] https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (11/2017).
[9] Y. Goto, I Nonaka, S Horai, A mutation in the
RNALeu (UUR) gene associated with the MELAS
subgroup of mitochondrial encephalomyopathies,
Nature 348(6302 (1990) 651
[10] http://www.mitomap.org/MITOMAP (11/2017).
[11] A. Lorenc, J. Bryk Golik P, Homoplasmic MELAS
A3243G mtDNA mutation in a colon cancer sample,
Mitochondrion 3(2) (2003) 119.
[12] EL. Blakely, J.W Yarham , C.L. Alston , K Craig , J.
Poulton , C. Brierley , SM. Park , A. Dean ,
JH. Xuereb , KN. Anderson , A. Compston , C.
Allen , S. Sharif , P. Enevoldson , M. Wilson , SR.
Hammans , DM. Turnbull , R. McFarland
, RW.Taylor , Pathogenic mitochondrial tRNA point
mutations: nine novel mutations affirm their
importance as a cause of mitochondrial disease, Hum
Mutat 34(9) (2013) 1260.
[13] S. DiMauro, Mitochondrial ADN medicine, Biosci
Rep 27(3) (2007) 5.
[14] DC. Wallace, D. Chalkia, Mitochondrial ADN
genetics and the heteroplasmy conundrum in
evolution
and disease”, Cold Spring Harb
Perspect
Biol
5(11)
(2013),
doi:10.1101/cshperspect. a021220



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×