Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phân lập vi khuẩn và tách chiết enzym urease từ môi trường nuôi cấy helicobacter pylori

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

NGHIÊN CỨU PHÂN LÂP VI KHUẨN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYM
UREASE TỪ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY HELICOBACTER PYLORI
Đỗ Hoàng Long*; Đỗ Minh Trung*
Lê Thu Hồng**; Lê Văn Đông*
TÓM TẮT
Ức chế enzym urease bằng kháng thể đặc hiệu theo đường uống là một hướng nghiên cứu mới
trong điều trị nhiễm Helicobacter pylori, nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh.
Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT);
nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng
thể kháng urease. Kết quả: đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết,
đạt tỷ lệ thành công 94,5%. Ba chủng H. pylori có hoạt độ urease cao được chọn và tăng sinh trong
môi trường Brucella broth. Tách chiết urease từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với
ammonium sulfate 50% bão hòa. Sản phẩm thu được có hoạt tính urease và tương đối tinh khiết.
Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính cho một băng đậm, tương ứng với tiểu đơn vị
có trọng lượng phân tử khoảng 60,3 kDa của urease.
* Từ khóa: Urease; Helicobacter pylori; Tách chiết enzym.

HELICOBACTER PYLORI ISOLATION AND UREASE EXTRACTION FROM
CULTURE BROTH SUPERNATANT


SUMMARY
Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in treatment of Helicobacter pylori
infection, coping with antibiotic resistance of this bacterium. This research aims to isolate H. pylori
from gastric-peptic ulcer biopsies and extract urease from bacterial culture broth to be used as
material for the development of antibody to urease. 17 H. pylori strains were obtained from 18 biopsy
samples (94.5%). Among them, three strains which showed highest urease activity were then
sub-cultured in Brucella broth. Urease was extracted from culture supernatant by precipitation with
ammonium sulfate 50% saturation. The obtained product maintained urease activity and relatively
pure. SDS-PAGE analysis in denature condition showed that, the urease contained product express
as a single band, corresponding with subunit B of urease with molecular masses of approximately
60.3 kDa.
* Key words: Urease; Helicobacter pylori; Enzyme extraction.
* Học viện Quân y
** Bệnh viện 103
Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 28/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/12/2013
Ngày bài báo được đăng: 18/12/2013

11


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm loét DD-TT là bệnh lý thường gặp
ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Tỷ lệ
mắc bệnh này khá cao, 60 - 70% ở Việt Nam,
còn ở các nước khác dao động từ 50 - 90%.
Có nhiều nguyên nhân gây viêm loét DDTT, trong đó, nguyên nhân thường nhắc
đến hiện nay là do nhiễm VK Helicobacter
pylori, chiếm 75 - 95% [3, 5, 10]. Việc điều
trị viêm loét DD-TT do nhiễm H. pylori rất
phức tạp, vì phải sử dụng phác đồ phối hợp
các thuốc kháng sinh với thuốc giảm toan,
giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng
quy cách. Tuy nhiên, khả năng thất bại trong
điều trị rất lớn, do tình trạng VK kháng kháng
sinh [1, 6]. Xuất phát từ thực tế lâm sàng,
nhu cầu tìm ra các thuốc mới có tác dụng
ức chế hoặc ngăn ngừa nhiễm H. pylori


mà không lo ngại tình trạng kháng thuốc,
trong đó có phương pháp miễn dịch trị liệu
thụ động sử dụng kháng thể kháng trực tiếp
H. pylori hoặc kháng enzym urease của
H. pylori, thành phần quan trọng trong quá
trình sinh bệnh của H. pylori, giúp chúng né
tránh, tồn tại và phát triển được trong môi
trường axít của dịch dạ dày, là một việc làm
triển vọng [8]. Từ đó, nghiên cứu này được
tiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK và
tách chiết urease từ H. pylori làm nguyên liệu
chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu.
18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết ổ loét DDTT qua nội soi của 18 bệnh nhân bị loét
DD-TT đến khám tại phòng khám nội soi
tiêu hóa, Bệnh viện 103 từ tháng 12 - 2011
và tháng 3 - 2012.
Các hóa chất sinh phẩm: BHI (Brainheart infusion broth) (BioRad, Mỹ), Brucella
broth (Neogen Corporation, Mỹ), huyết thanh

bào thai bê (FBS - Fetal bovine serum)
(Gibco, Mỹ), Pylori agar (BioMérieux, Pháp)
và túi ủ GENbag microear (BioMérieux, Pháp).
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Phân lập và định danh H. pylori từ bệnh
phẩm:
Bệnh phẩm sinh thiết qua nội soi được
bảo quản trong ống nghiệm chứa BHI broth
vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm
tại Bộ môn Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103. Tại
đây, nghiền nát bệnh phẩm bằng dụng cụ
vô trùng và nuôi cấy phân lập chọn lọc
trong đĩa petri chứa môi trường Pylori agar
đặt trong túi vi hiếu khí GENbag microear
(5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở
37oC. VK được phân lập sau 5 ngày nuôi
cấy và định danh bằng nhuộm Gram, các
phản ứng sinh hóa như oxidase, catalase
và urease [3, 5].
* Nuôi cấy tăng sinh H. pylori và tách
chiết urease từ dịch nuôi cấy:
Nuôi cấy các chủng H. pylori có hoạt tính
urease mạnh nhất tăng sinh trong môi
trường Brucella broth trong tủ ấm 37oC có
lắc liên tục trong 72 giờ. Urease được tách
chiết từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa
phân đoạn với ammonium sulfate 50% độ
bão hòa. Sản phẩm kết tủa được thẩm tích
loại muối, xác định hoạt tính urease, xác
định độ tinh sạch và kích thước. Xác định
hoạt tính urease trong dịch nuôi cấy và sản
phẩm sau mỗi bước tách chiết nhờ test
urease theo nguyên lý urease thủy phân ure
thành ammonia, tạo môi trường kiềm và
chuyển chỉ thị màu đỏ phenol trong môi
trường phản ứng thành màu hồng cánh sen
có độ hấp phụ quang mạnh nhất ở bước
sóng 340 nm. Xác định nồng độ protein
enzym thu được bằng kỹ thuật Bradford.
Xác định độ tinh sạch và kích thước của

13


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014
sản phẩm bằng phương pháp điện di SDSPAGE 10% trong điều kiện biến tính.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Phân lập VK.
Sau 5 ngày nuôi cấy, 17/18 mẫu phân
lập (94,5%) (trừ mẫu số 10) có VK mọc với
hình ảnh khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám
trong, đường kính 0,5 - 1 mm.

Kết quả nhuộm Gram và các phản ứng
sinh hóa cho thấy cả 17 chủng phân lập đều
cho kết quả nhuộm Gram (-) và hình thể đa
số là hình cong, mức độ xoắn nhẹ, không
điển hình. Kết quả các phản ứng sinh hóa
để định danh H. pylori gồm urease, oxydase
và catalase đều cho kết quả dương tính.
Bảng 1: Kết quả nuôi cấy phân lập và định
danh VK.
PHẢN ỨNG SINH HÓA

MÃ SỐ
NGHIÊN
CỨU

NUÔI
CẤY

01
02
03

+
+
+

NHUỘM
GRAM Urease Oxydase Catalase
+
+
+

+
+
+

+
+
+

+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

08

+

+

+

+

+

09

+

+

+

+

+

10

-

11

+

+

+

+

+

12

+

+

+

+

+

13

+

+

+

+

+

14

+

+

+

+

+

15

+

+

+

+

+

16

+

+

+

+

+

17

+

+

+

+

+

18

+

+

+

+

+

H. pylori là một trong những VK rất khó
phân lập và chỉ mọc ở những môi trường
chuyên biệt với điều kiện thích hợp. Pylori
agar và túi ủ GENbag microear (5% O2,
10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở 37oC
được xác định là thích hợp cho chúng tăng
sinh theo khuyến cáo của nhiều tác giả [5].
Đó có thể là lý do giải thích tại sao tỷ lệ
phân lập H. pylori của chúng tôi đạt được
94,5%, cao hơn các tác giả khác trong nước
(47 - 56,4%) [1].
2. Tách chiết urease.
0.7
OD (340 nm)

Hình 1: Khuẩn lạc thu được khi nuôi cấy
trong môi trường vi hiếu khí.

04
05
06
07

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
01 02 03 04 05 06 07 08 09 11 12 13 14 15 16 17 18
Chñng vi khuÈn Helicobacter pylori

Hình 2: Kết quả phản ứng urease của các
chủng H.pylori thu được.
14


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014
Kết quả phân tích hoạt tính urease trong
dịch nổi của 17 chủng VK nghiên cứu nhận
thấy 3 chủng H. pylori (HP13, HP16 và
HP18) có hoạt tính cao hơn và hoạt tính
này còn cao hơn nữa sau khi cho tăng sinh
lần 1 (sau 24 giờ), lần 2 (qua đêm) và lần 3
(sau 48 giờ) của cả 3 chủng H. pylori này
[4, 8]. Ba chủng HP13, HP16 và HP18
được lựa chọn để nuôi cấy tăng sinh và
phân lập urease

tiểu đơn vị. Tuy nhiên, kết quả thu được chỉ
gần giống nhau chứ không trùng khớp với
nhau hoàn toàn, mặc dù cùng chung một
phương pháp xác định. Điều này chứng
tỏ urease từ các chủng khác nhau của
H. pylori có một số khác biệt về phân tử
lượng từng chuỗi tiểu đơn vị. Trong nghiên
cứu này, trên băng điện di của ba chủng VK
H. pylori cũng chỉ có một vạch sáng nhất,
tương đương nhau và tương ứng về lý thuyết
với kích thước của tiểu đơn vị B trong phân
tử urease. Tại Việt Nam, mới chỉ có nghiên
cứu tách chiết, tinh sạch urease từ thực vật
và hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên
cứu về urease của VK H. pylori [2].
KẾT LUẬN

Hình 3: Điện di SDS-PAGE 10%. M: protein
chuẩn; HP13, PH16, HP18 là sản phẩm kết
tủa của các chủng tương ứng.
Bằng phương pháp kết tủa phân đoạn
dịch nuôi cấy các chủng HP13, HP16 và
HP18 với ammonium sulfate 50% thu được
lượng protein có hoạt tính urease lần lượt
là 1,78 mg/ml, 1,95 mg/ml và 1,71 mg/ml.
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm thu
được sau kết tủa và thẩm tích tương đối
thuần nhất, trong đó, băng đậm nhất có
kích thước khoảng 60,3 kDa.
Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu
về enzym urease của H. pylori và các đặc
tính của chúng về phân tử lượng của chuỗi

Đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ
18 mẫu sinh thiết ổ loét DD-TT. Đã tách
chiết được enzym urease từ dịch nuôi cấy
của 3 chủng sinh urease với hoạt tính cao
nhất; sản phẩm thu được còn giữ được
hoạt tính urease đặc trưng, tương đối tinh
khiết, có thể sử dụng làm nguyên liệu gây
miễn dịch tạo kháng thể kháng urease.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai. Tính
đề kháng kháng sinh của Helicobacter pylori
trong bệnh viêm loét DD-TT. Y học Thành phố
Hồ Chí Minh. 2006, 10 (1), tr.73-75.
2. Lê Thị Phú & Nguyễn Thị Cẩm Vi. Xác
định phân tử lượng và các thông số động học
của urease từ đậu nành hạt vàng Việt Nam. Tạp
chí Phát triển KH & CN. 2007, 10 (5), tr.41-50.

15


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014
3. Phùng Đắc Cam, Nguyễn Thái Sơn.
Helicobacter pylori và bệnh viêm, loét DD-TT.
Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2003, tr.7-104.
4. Icatlo FC, Kuroki M, Kobayashi C,
Yokoyama H, Ikemori Y, Hashi T et al. Affinity
purification of Helicobacter pylori urease. J Biol
Chem. 1998, 273 (29), pp.18130-18138.
5. Kusters JG, van Vliet AHM & Kuipers EJ.
Pathogenesis of Helicobacter pylori infection.
Clin Microbiol Rev. 2006, 19 (3), pp.449-490.
6. Malfertheiner P, Megraud F, O'Morain CA,
Atherton J, Axon AT, Bazzoli F et al. Management
of Helicobacter pylori infection--the Maastricht
IV/Florence Consensus Report. Gut. 2012, 61 (5),
pp.646-664.

7. Mobley HLT, Island MD & Hausinger RP.
Molecular biology of microbial ureases. Microbiol
Rev. 1995, 59 (3), pp.451-480.
8. Suzuki H, Nomura S, Masaoka T, Goshima H,
Kamata N, Kodama Y, et al. Effect of dietary
anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin
Y on Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol
Ther. 2004, 20 (1), pp.185-192.
9. Turbett GR, Høj PB, Horne R & Mee BJ.
Purification and characterization of the urease
enzymes of Helicobacter species from humans
and animals. Infect Immun. 1992, 60 (12),
pp.5259-5266.
10. Versalovic J. Helicobacter pylori: pathology
and diagnostic strategies. Am J Clin Pathol.
2003, 119, pp.403-412.

16


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

17



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×