Tải bản đầy đủ

Tác động của chiết xuất từ hạt nhân trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của tế bào dây chằng nha chu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015

Nghiên cứu Y học

TÁC ĐỘNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ HẠT NHÃN TRÊN KHẢ NĂNG SỐNG,
DI CHUYỂN VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU
Nguyễn Thu Thuỷ*, Aree Wanasuntronwong**, Rudee Surarit**

TÓM TẮT
Mở đầu: Các loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ cây cỏ đã trở thành một hướng quan trọng trong điều trị
bệnh vùng miệng bao gồm viêm nướu và viêm nha chu. Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) đã được nghiên cứu về
khả năng ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh lí, tuy nhiên chưa có trong lĩnh vực này.
Mục tiêu: Nghiên cứu tác động của CXHN trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của tế bào dây
chằng nha chu (TBDCNC) bằng các kĩ thuật cơ bản.
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm MTT được dùng để đánh giá khả năng sống và tăng
trưởng của TBDCNC trong nuôi cấy; khả năng di chuyển được đánh giá bằng chương trình Image Pro Plus
Program và đếm tế bào trong vùng đánh dấu.
Kết quả: Nồng độ ức chế 50% (IC50) của CXHN trên TBDCNC là 1,47 mg/ml sau 24 giờ và 0,15 mg/ml
sau 48 giờ. CXHN nồng độ 1 mg/ml ức chế sự di chuyển của tế bào nhưng tác động này giảm khi liều lượng
giảm. Cả hai nông độ đều có vẻ ức chế sự tăng trưởng của TBDCNC.
Kết luận: CXHN ảnh hưởng trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của TBDCNC, tác động giảm

khi nồng độ giảm. Với khả năng kháng viêm, đây là một chất tiềm năng trong điều trị bệnh nha chu, tuy nhiên
cần các nghiên cứu khác với các nồng độ khác nhau để đi đến kết luận.
Từ khoá: chiết xuất từ hạt nhãn, tế bào dây chằng nha chu, khả năng sống, di chuyển, tăng trưởng.

ABSTRACT
EFFECTS OF LONGAN SEED EXTRACT ON SURVIVAL, MIGRATION AND PROLIFERATION OF
PERIODONTAL LIGAMENT CELLS
Nguyen Thu Thuy, Aree Wanasuntronwong, Rudee Surarit
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 2 - 2015: 1 - 5
Background: Traditional herbal medicine has become an important orientation in treatment of oral diseases
including gingivitis and periodontitis. The Longan seed extract (LSE) has been studied for their potential
application in numerous diseases, but not yet in this field.
Objectives: The aim of this study was to investigate the effects of LSE on the viability, the migration and the
proliferation of periodontal ligament cells (PDLCs) by using basic techniques.
Materials and methods: The MTT assay was used to assess the cytotoxicity and the proliferation of PDLCs
in culture; the cell migration was estimated by using Image Pro Plus Program and by counting the number of
cells in the migration area.
Results: The IC50 of LSE on PDLCs was approximately 1.47 mg/ml after 24 hours and 0.15 mg/ml after 48
hours of incubation. The LSE at 1 mg/ml inhibited the migration of PDLCs but the effect was reduced with lower
dose. The LSE both at 1 mg/ml and 0.05 mg/ml seemed to be inhibitive on the proliferation of PDLCs.
Conclusion: The LSE has effect on the survival, migration and proliferation of PDLCs. In considering its
* Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt- Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
**

Bộ môn Sinh học miệng, Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan
Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thu Thuỷ
ĐT: 01208505265 Email: ngthuthuy20@yahoo.com

Chuyên Đề Răng Hàm Mặt

1


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015

anti-inflammatory effect and paying attention to the concentration in use, other studies are in need to explore the
application potential of this extract in treatment of periodontal diseases based on inexpensive natural products.
Key words: Longan seed extract, periodontal ligament cells, survival, migration, proliferation.


kháng sinh. Cấy chuyển khi mật độ tế bào dày
ĐẶT VẤN ĐỀ
đặc, các tế bào kết dính với nhau.
Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy tình
Chuẩn bị dung dịch CXHN
trạng vệ sinh răng miệng ở nhóm tuổi 35 – 44
CXHN do Phòng thí nghiệm Đại học
kém với nhiều vôi răng, mảng bám; hầu hết các
Chulalongkorn, Thái Lan cung cấp, sau đó được
đối tượng có ít nhất một vị trí có mất bám dính ≥
pha loãng với Dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo
2 mm. Ở Thái Lan, tỉ lệ viêm nha chu nhẹ, trung
(10)
thành dung djch CXHN với nồng độ khác nhau.
bình và nặng lần lượt là 30,5, 53,6 và 15,9 . Ở cả
hai nước, các loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc
từ cây cỏ đã trở thành một hướng trong nỗ lực
quốc gia nhằm tăng cường sức khoẻ cộng đồng ở
vùng nông thôn, trong đó bao gồm sức khoẻ
răng miệng nói chung và mô nha chu nói
riêng(12,9).
Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) chứa
polysaccharides có tác động kháng oxy hoá in
vitro phụ thuộc vào nồng độ(3). Liều khẩn cấp và
liều lập lại của CXHN dùng theo đường uống đã
được kết luận là không gây độc, từ đó có thể sử
dụng an toàn dưới kiểm soát trong các nghiên
cứu độc tính dài hạn và/hoặc thử nghiệm lâm
sàng(13). CXHN hiện đang được nghiên cứu về
khả năng chống ung thư(5,6), kháng nấm(7), chống
mệt mỏi(15), nhưng chưa từng được tìm hiểu về
khả năng ứng dụng trong điều trị bệnh vùng
miệng. Mặt khác, các tác động của CXHN in vitro
trên tế bào nuôi cấy, đặc biệt là trên tế bào dây
chằng nha chu (TBDCNC), cũng chưa được
đánh giá đầy đủ. Do đó, mục tiêu của nghiên
cứu này nhằm tìm hiểu tác động của CXHN trên
khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của
TBDCNC bằng các thử nghiệm cơ bản.

ĐỐI TƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Nuôi cấy tế bào
TBDCNC của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi
cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection,
ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco
biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum,
DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết thanh
phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1%

2

Tác động của CXHN trên khả năng sống
của TBDCNC
TBDCNC được gieo vào bảng mẫu siêu nhỏ
(microtiter plates, 96 well plates) với mật độ
20.000 tế bào/well. Đếm tế bào bằng buồng đếm
hematocytometer (Improve Neubauer®). Các
bảng mẫu sau đó được ủ ấm trong máy ủ CO2
(37o C, 5% CO2, độ ẩm 100%) trong 24 giờ để đạt
mức bão hoà. Dung dịch CXHN với nồng độ 5
mg/ml, 1 mg/ml, 0,1 mg/ml và 0,01 mg/ml được
cho vào well (4 well cho mỗi nồng độ). Dung
dịch đệm phosphate saline (Phosphate buffer
saline, PBS) được đặt vào well trắng.
Chlorhexidine 0,12% được dùng làm chứng
dương và môi trường nuôi dưỡng dùng để làm
chứng âm. Tiếp tục đặt bảng mẫu vào tủ ủ trong
24 giờ và 48 giờ. Khả năng sống của tế bào được
xác định bằng thử nghiệm MTT. Đọc kết quả với
quang phổ kế ở bước sóng 540 nm. Lập lại thử
nghiệm 2 lần với kết quả không khác biệt có ý
nghĩa thống kê. Kết quả chỉ được chấp nhận khi
hệ số biến thiên dưới 15%.

Tác động của CXHN trên khả năng di
chuyển của TBDCNC
TBDCNC được cấy vào bảng mẫu 24 well
(24 well plates) với mật độ 50.000 tế bào/well,
ủ trong tủ ủ CO2 trong 48 giờ để đạt mức bão
hoà. Sau đó, dùng đầu pipette 1000 μl vạch
một đường ngang qua trung tâm đáy well.
Kiểm tra dưới kính hiển vi cho thấy không còn
tế bào trong vùng vạch. Thêm 500 μl dung
dịch CXHN với nồng độ 1 mg/ml và 0,05

Chuyên Đề Răng Hàm Mặt


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015
mg/ml vào các well (4 well cho mỗi nồng độ).
Theo dõi sự di chuyển tế bào sau 3, 6 và 24
giờ. Sau 24 giờ, rửa tế bào với PBS 1X, cố định
với methanol trong 2 phút, rửa lại 2 lần trước
khi nhuộm với xanh toludine (toludine blue
0,25%). Chụp hình dưới kính hiển vi. Đo vùng
tế bào di chuyển với chương trình Image Pro
Plus Program, sau đó đếm tế bào trong vùng
xác định bằng đường vạch đầu pipette.

Tác động của CXHN trên sự tăng trưởng
TBDCNC
Cấy TBDCNC vào bảng mẫu 96 well với mật
độ 2.000 tế bào/well. Sau khi ủ 24 giờ, cho dung
dịch CXHN nồng độ 1 mg/ml và 0,05 mg/ml vào
các well (4 well cho mỗi nồng độ). Chlorhexidine
0,12% dược dùng làm chứng âm và yếu tố tăng
trưởng cho nguyên bào sợi của người (human
fibroblast growth factor, hFGF basic/FGF2) 0,2
μg/ml được dùng làm chứng dương. Ủ bảng
mẫu trong tủ ủ và thực hiện thử nghiệm MTT
sau 1, 3, 6, 7 ngày. Đọc kết quả với quang phổ kế

Nghiên cứu Y học

với bước sóng 540 nm. Lập lại thử nghiệm 2 lần
với kết quả không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Kết quả chỉ được chấp nhận khi hệ số biến thiên
dưới 15%.

Phân tích số liệu
Xác địnhh kiểu phân phối số liệu bằng test
Kolmogorov Smirnov. Sử dụng test one-way
ANOVA và test one-way Kruskal-Wallis trong
chương trình SigmaStat version 3.5 để phân tích
thống kê. Giá trị p ≤ 0,05 được xem là có ý nghĩa
thống kê.

KẾT QUẢ
Tác động của CXHN trên khả năng sống
của TBDCNC
Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory
concentration 50%, IC50) là nồng độ của một mẫu
có thể ức chế sự sống của 50% số lượng tế bào
trong những điều kiện xác định. IC50 của dung
dịch CXHN sau 24 giờ và 48 giờ lần lượt là 1,47
mg/ml và 0,15 mg/ml.

Tác động của CXHN trên khả năng di chuyển của TBDCNC
Bảng 1. Diện tích vùng di chuyển của TBDCNC sau 24 giờ ủ với các dung dịch
Dung dịch

Nồng độ
(mg/ml)

Dung dịch dinh dưỡng (DMEM + 10% FBS + 1%
kháng sinh) (Chứng âm)
hFGF basic/FGF2 (Chứng dương)
CXHN

Diện tích vùng di chuyển
2
Trung bình  sai số chuẩn (mm )

P

0,25  0,05
0,0002
1,00
0,05

0,31  0,03
0,06  0,01
0,19  0,03

*

p<0,05
*
p<0,05
*
p<0,05

*

So sánh với nhóm chứng âm, test one-way ANOVA
Bảng 2. Số lượng TBDCNC trong vùng di chuyển sau 24 giờ ủ với các dung dịch
Dung dịch
Dung dịch dinh dưỡng (Chứng âm)
hFGF basic/FGF2 (Chứng dương)
CXHN

*

Nồng độ (mg/ml)

0,0002
1,00
0,05

Số lượng TBDCNC
Trung bình  Sai số chuẩn (tế bào)
304,00  12,92
385,67  27,84
49,17  4,80
169,17  4,92

P

*

p<0,05

*

p<0,05
*
p<0,05

So sánh với nhóm chứng âm, test one-way ANOVA

Chuyên Đề Răng Hàm Mặt

3


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015

Tác động của CXHN trên sự tăng trưởng TBDCNC

Biểu đồ 1. Ảnh hưởng của dung dịch CXHN trên sư tăng trưởng của TBDCNC

BÀN LUẬN
Trong thí nghiệm đầu tiên về ảnh hưởng của
CXHN trên khả năng sống của TBDCNC, IC50
của dung dịch CXHN sau 24 giờ và 48 giờ lần
lượt là 1,47 mg/ml và 0,15 mg/ml. Kết quả này bổ
sung cho nhận định tác động của CXHN thay
đổi theo nồng độ của Jiang và cs.(3). Kết quả thí
nghiệm này gợi ý các nồng độ được sử dụng
trong các thí nghiệm tiếp theo về tác động của
CXHN trên khả năng di chuyển và tăng trưởng
của TBDCNC. Đồng thời trong thí nghiệm này,
Chlorhexidine nồng độ 0,12% được dùng làm
nhóm chứng dương. Dưới 7% TBDCNC tồm tại
sau 24 giờ và 48 giờ ủ với dung dịch
Chlorhexidine ở nồng độ thường được khuyến
cáo dùng làm nước súc miệng trong điều trị
bệnh nha chu và sau phẫu thuật miệng(8). Kết
quả này tương đồng với một nghiên cứu khác
năm 2013 cho thấy dung dịch Chlorhexidine pha
loãng làm giảm khả năng di chuyển và tồn tại
dài hạn của tế bào(11).
Tế bào khi được ủ với dung dịch hFGF
basic/FGF2 0.2 μg/ml có vùng di chuyển và số

4

lượng tế bào di chuyển lớn nhất, khi so sánh với
dung dịch dinh dưỡng, CXHN 1 mg/ml và 0,05
mg/ml. Điều này khác biệt với nghiên cứu của
Zhang và cs. năm 2013 trong đó nhóm tế bào
được kích thích với cùng yếu tố tăng trưởng
không cho thấy tác động làm tăng khả năng di
chuyển(14). Dung dịch CXHN 1 mg/ml có vẻ ức
chế sự di chuyển của TBDCNC, tác động này
giảm khi nồng độ giảm do diện tích vùng tế bào
di chuyển cũng như số lượng tế bào di chuyển
trong môi trường nồng độ 1 mg/ml và 0,05
mg/ml khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Trong thí nghiệm về ảnh hưởng của CXHN
trên khả năng tăng trưởng của TBDCNC, ở ngày
1 và 3 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
về số lượng tế bào còn sống giữa nhóm chứng
dương, nhóm chứng âm, dung dịch CXHN 1
mg/ml và 0,05 mg/ml (p>0,05). Tiếp theo, có sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chứng
dương và các dung dịch: nhóm chứng âm,
CXHN 1 mg/ml, CXHN 0,05 mg/ml (p<0,05).
Trong khi đó, không có sự khác biệt có ý nghĩa
giữa dung dịch CXHN 1mg/ml cũng như 0,05
mg/ml và nhóm chứng âm p>0,05). Kết quả thí

Chuyên Đề Răng Hàm Mặt


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015
nghiệm tương tự kết luận của Chung và cs. năm
2010 rằng CXHN ngăn cản sự tổng hợp DNA(1).

5.

Như vậy, mặc dù đặc tính kháng viêm,
kháng oxy hoá của dung dịch CXHN đã được
nhiều nghiên cứu chứng minh và hiện nay dung
dịch này đang được tìm hiểu về khả năng ứng
dụng trong điều trị nhiều bệnh toàn thân, cần có
những nghiên cứu khác in vitro và in vivo để làm
rõ tác động của CXHN trên mô trong miệng, đặc
biệt là trên TBDCNC, một cấu trúc cơ bản của
mô nha chu và có khả năng ảnh hưởng đến
những đáp ứng phản vệ của cơ thể bằng cách
tương tác với các tế bào miễn dịch(4).

6.

7.

8.

9.

KẾT LUẬN
CXHN ảnh hưởng trên khả năng sống, di
chuyển và tăng trưởng của TBDCNC, tác động
giảm khi nồng độ giảm. Với khả năng kháng
viêm, đây là một chất tiềm năng trong điều trị
bệnh nha chu, tuy nhiên cần các nghiên cứu
khác với các nồng độ khác nhau để đi đến kết
luận.
Cám ơn: Các kĩ thuật viên Sirinthip Choonate, Duangchewan
Puengsurin, Ratchaporn Srichan, Suparporn Mala thuộc Bộ môn
Sinh học miệng và Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu của khoa Nha,
Đại học Mahidol, Thái Lan.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

Chung YC, Lin CC, Chou CC, Hsu CP (2010). The effect of
Longan seed polyphenols on colorectal carcinoma cells. Eur J
Clin Invest. 40(8):713-21.
Do LG, Spencer JA, Roberts-Thomson K, Ha DH, Tran TV,
Trinh HD (2003). Periodontal disease among the middle-aged
Vietnamese population. J Int Acad Periodontol. 5(3):77-84.
Jiang G, Wen L, Chen F, Wu F, Lin S, Yang B, Jiang Y (2013).
Structural characteristics and antioxidant activities of
polysaccharides from longan seed. Carbohydr Polym. 92(1):75864.
Konermann A, Stabenow D, Knolle PA, Held SA, Deschner J,
Jäger A (2012). Regulatory role of periodontal ligament
fibroblasts for innate immune cell function and differentiation.
Innate Immun. 18(5):745-52.

Chuyên Đề Răng Hàm Mặt

10.

11.

12.

13.

14.

15.

Nghiên cứu Y học

Lin CC, Chung YC, Hsu CP (2012). Potential roles of longan
flower and seed extracts for anti-cancer.World J Exp Med.
2(4):78-85.
Panyathep A, Chewonarin T, Taneyhill K, Vinitketkumnuen
U, Surh YJ (2013). Inhibitory effects of dried longan (Euphoria
longana Lam.) seed extract on invasion and matrix
metalloproteinases of colon cancer cells. J Agric Food Chem.
61(15):3631-41.
Rangkadilok N, Tongchusak S, Boonhok R, Chaiyaroj SC,
Junyaprasert VB, Buajeeb W, Akanimanee J, Raksasuk T,
Suddhasthira T, Satayavivad J (2012). In vitro antifungal
activities of longan (Dimocarpus longan Lour.) seed extract.
Fitoterapia. 83(3):545-53.
Rath SK, Singh M (2013). Comparative clinical and
microbiological efficacy of mouthwashes containing 0.2% and
0.12% chlorhexidine. Dent Res J (Isfahan). 10(3):364-9.
Sastravaha G, Yotnuengnit P, Booncong P, Sangtherapitikul P
(2003). Adjunctive periodontal treatment with Centella
asiatica and Punica granatum extracts. A preliminary study. J
Int Acad Periodontol. 5(4):106-15.
Torrungruang K, Tamsailom S, Rojanasomsith K, Sutdhibhisal
S, Nisapakultorn K, Vanichjakvong O, Prapakamol S,
Premsirinirund T, Pusiri T, Jaratkulangkoon O, Unkurapinun
N, Sritara P (2005). Risk indicators of periodontal disease in
older Thai adults. J Periodontol. 76(4):558-65.
Tsourounakis I, Palaiologou-Gallis AA, Stoute D, Maney P,
Lallier TE (2013). Effect of essential oil and chlorhexidine
mouthwashes on gingival fibroblast survival and migration. J
Periodontol. 84(8):1211-20.
Wahlberg A (2006). Bio-politics and the promotion of
traditional herbal medicine in Vietnam. Health (London).
10(2):123-47.
Worasuttayangkurn L, Watcharasit P, Rangkadilok N,
Suntararuks S, Khamkong P, Satayavivad J (2012). Safety
evaluation of longan seed extract: acute and repeated oral
administration. Food Chem Toxicol. 50(11):3949-55.
Zhang R, Zhang M, Li CH, Wang PC, Chen F, Wang QT
(2013). Effects of basic fibroblast growth factor and vascular
endothelial growth factor on the proliferation, migration and
adhesion of human periodontal ligament stem cells in vitro.
Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 48(5):278-84.
Zheng SQ, Jiang F, Gao HY, Zheng JG (2010). Preliminary
observations on the antifatigue effects of longan (Dimocarpus
longan Lour.) seed polysaccharides. Phytother Res. 24(4):622-4.

Ngày nhận bài báo:
Ngày phản biện nhận xét bài báo:
Người phản biện:
Ngày bài báo được đăng:

25/01/2015
02/03/2015
TS Phan Ái Hùng
10/04/2015

5



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×