Tải bản đầy đủ (.pdf) (8 trang)

Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da trên động vật thực nghiệm của dung dịch mafenid acetat

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (542.54 KB, 8 trang )

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO VÀ
TÍNH KÍCH ỨNG DA TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
CỦA DUNG DỊCH MAFENID ACETAT
Lương Quang Anh*; Nguyễn Như Lâm*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da của dung dịch mafenid
acetate (MA) trên các chủng vi khuẩn (VK) thƣờng gặp trong bỏng trên thỏ thực nghiệm .
Phương pháp: sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá tác dụng kháng khuẩn
in vitro. 6 thỏ khỏe mạnh đƣợc đắp thuốc trên da lƣng và theo dõi điểm kích ứng da sau 72 giờ
tiếp xúc. Kết quả: thuốc có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella flexneri, Salmonella typhi,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus
cereus, Sarcina lutea. Đồng thời, thuốc cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Pseudomonas
aeruginosa phân lập đƣợc tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia. Tuy nhiên, VK vẫn
phát triển mạnh khi tiếp xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5%. Điểm kích ứng bằng 0 khi đắp
thuốc trên lƣng của thỏ thí nghiệm. Kết luận: dung dịch MA 5% có tác dụng kháng khuẩn tốt với
nhiều chủng VK, trong đó có trực khuẩn mủ xanh phân lập đƣợc tại Viện Bỏng Quốc gia và
không kích ứng khi sử dụng trên thỏ.
* Từ khóa: Mafenid acetat; Tác dụng kháng khuẩn; Kích ứng da.

Evaluation of Antibacterial Activities In Vitro and Skin Irritation of
Mafenide Acetate Solution on Rabbits
Summary
Objectives: Evaluation of antibacterial activities in vitro and skin irritation of mafenide acetate
(MA) solution on rabbits. Methods: Determination of antibacterial activities in vitro by the agar
well diffusion method. Assessment of skin irritation grade on 6 healthy rabbits that were topically
applied the drug on its back after 72 hours of contact. Results: The drug had effectiveness on
Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus
pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea. With regard to Pseudomonas aeruginosa
isolated from samples obtained at Intensive Care Unit, MA solution showed its germicide similarly.


Conversely, the baterium kept with its powerful growth when the drug at doses below 5% was
applied on. The skin irritation grade was at zero. Conclusions: The drug showed good antimicrobial
activities on some bacteria species including Pseudomonas aeruginosa isolated from our hospital.
It had no skin irritation when applied on experimental rabbits.
* Key words: Mafenide acetate; Antibacterial activities; Skin irritation.
* Viện Bỏng Qu c gia
** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lương Quang Anh (luongquanganh@vmmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 27/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/09/2015
Ngày bài báo được đăng: 18/09/2015

17


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tại Việt Nam, nhiễm khuẩn trong bỏng
đang trở thành vấn đề lớn, ảnh hƣởng
trực tiếp đến chất lƣợng điều trị bệnh
nhân (BN), nhất là trong tình trạng còn
thiếu các thuốc kháng khuẩn tại chỗ thực
sự có hiệu quả. Trong đó, trực khuẩn mủ
xanh là VK Gram âm hàng đầu gây nhiễm
khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở các BN bỏng.
Điều trị vết thƣơng, vết bỏng nhiễm trực
khuẩn mủ xanh rất khó khăn vì VK này có
khả năng đề kháng cao đối với hầu hết
các thuốc kháng sinh, đặc biệt là các
chủng đa kháng kháng sinh, làm tăng chi

phí điều trị cũng nhƣ làm tăng tỷ lệ tử
vong ở BN bỏng [1, 2, 3].
MA là thuốc thuộc nhóm sulfamid đã
đƣợc sử dụng ở các trung tâm điều trị
bỏng trên thế giới. Đây là thuốc có độ an
toàn cao, hiệu quả diệt khuẩn tốt, trong
đó có trực khuẩn mủ xanh. MA chủ yếu
sử dụng dƣới dạng dung dịch và dạng
kem, dùng đơn lẻ hoặc kết hợp với một
thuốc kháng khuẩn khác. Viện Bỏng Quốc
gia đã bào chế thành công dung dịch MA
5% đạt tiêu chuẩn cơ sở. Vì vậy, nghiên
cứu này đƣợc thực hiện nhằm: Bước đầu
đánh giá tác dụng háng huẩn in vitro và
tính ích ứng da của chế phẩm, làm cơ
sở hoa học cho việc ứng dụng chế phẩm
này trong điều trị BN bỏng.
NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên vật liệu và đối tƣợng
nghiên cứu.
* Nguyên vật liệu:
- Dung dịch MA 5% do Viện Bỏng Quốc
gia sản xuất, đạt tiêu chuẩn cơ sở.
18

- Thuốc đối chiếu: streptomycin sulfat
16 IU/ml đối với thử kháng khuẩn VK
Gram (-), benzathin penicillin 20 IU/ml đối
với thử kháng khuẩn VK Gram (+). Môi

trƣờng canh thang nuôi cấy vi sinh vật
gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt
0,3%, nƣớc vừa đủ 100 ml. Môi trƣờng
thạch thƣờng gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%,
cao thịt 0,3%, thạch 1,6%, nƣớc vừa đủ
100 ml.
* Đ i tượng nghiên cứu:
- Chủng vi sinh vật kiểm định do Bộ
môn Vi sinh - Sinh học, Đại học Dƣợc
Hà Nội cung cấp, bao gồm: VK Gram (-):
Escherichia coli (EC), Proteus mirabilis (Pro),
Shigella flexneri (Shi), Salmonella typhi
(Sal), Pseudomonas aeruginosa (Pseu).
VK gram (+): Staphylococcus aureus (SA),
Bacillus pumilus (BP), Bacillus subtilis (BS),
Bacillus cereus (BC), Sarcina lutea (Sar).
- Phân lập chủng trực khuẩn mủ xanh
từ mẫu bệnh phẩm tại Khoa Hồi sức Cấp
cứu, Viện Bỏng Quốc gia. 6 thỏ đực khỏe
mạnh, cân nặng 2.000 ± 100 g, đạt tiêu
chuẩn thí nghiệm.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Phương pháp đánh giá tác dụng háng
huẩn in vitro:
- Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm
bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch
đối với một số chủng VK quốc tế.
+ Tiến hành: các khoanh giấy lọc vô
trùng đƣợc tẩm 3 lần với dung dịch mẫu
thử, sấy ở nhiệt độ < 60oC đến khô hết

dung môi. Cấy vi sinh vật kiểm định vào
môi trƣờng canh thang, nuôi cấy cho phát
triển trong tủ ấm 37oC từ 18 - 24 giờ đến
nồng độ 107 tế bào/ml. Môi trƣờng thạch
thƣờng vô trùng (làm lạnh về 45 - 500C)


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015

đƣợc cấy vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ
2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để vi sinh vật
phân tán đều trong môi trƣờng thạch
thƣờng, đổ vào đĩa petri vô trùng với thể
tích 20 ml/đĩa, để thạch đông lại. Khoanh
giấy lọc đã tẩm chất thử đặt lên bề mặt
môi trƣờng thạch thƣờng chứa vi sinh vật
theo sơ đồ định sẵn. Ủ các đĩa petri có
mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC
trong 18 - 24 giờ. Đọc kết quả, đo đƣờng
kính vòng vô khuẩn bằng thƣớc kẹp
Panmer có độ chính xác 0,02 mm.
+ Đánh giá kết quả: dựa vào đƣờng
kính vòng vô khuẩn và đánh giá theo công
thức sau:
n

D
D=



i 1

n



n

i

SD =  ( D  D)
i 1

2

i

n 1



D : Đƣờng kính trung bình vòng vô
khuẩn, Di: Đƣờng kính vòng vô khuẩn.
SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu
chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song.
- Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm
bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch
đối với Pseudomonas aeruginosa phân
lập tại Viện Bỏng Quốc gia.
* Tiến hành: tạo một lỗ có đƣờng kính

10 mm trên bề mặt đĩa thạch. Đổ dung
dịch thử vào lấp đầy lỗ trên bề mặt môi
trƣờng thạch thƣờng chứa Pseudomonas
aeruginosa đã phân lập từ mẫu bệnh phẩm
tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng
Quốc gia theo sơ đồ định sẵn. Ủ các đĩa
petri có mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ
37oC trong 24 giờ. Sau đó, lấy các đĩa petri
ra đọc kết quả. Đo đƣờng kính vòng vô
khuẩn bằng thƣớc chia độ tính bằng mm.

- Xác định sơ bộ sự phát triển của
Pseudomonas aeruginosa phân lập tại
Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc
ở các nồng độ khác nhau.
Từ dung dịch MA 5%, tiến hành pha
các dung dịch MA có nồng độ giảm dần
tƣơng ứng với nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16
và 1/32 so với nồng độ MA 5%. Hút chính
xác 1 ml dung dịch này cho vào ống nghiệm
chứa 100 µl hỗn dịch chứa 108 VK/ml.
Cấy hỗn dịch VK và thuốc vào các đĩa
petri thạch thƣờng, để trong tủ ấm ở nhiệt
độ 370C trong 24 giờ. Sau đó, lấy các đĩa
petri ra để theo dõi sự phát triển của VK
trên các đĩa thạch tƣơng ứng với VK tiếp
xúc với thuốc ở nồng độ khác nhau.
* Phương pháp đánh giá tính ích ứng
da trên thỏ thực nghiệm:
- Thử nghiệm tiến hành trên 6 thỏ.

Trên mỗi thỏ, mỗi bên tại vùng da lƣng đã
cạo, đắp thuốc thử dạng dung dịch. Bên
phải đặt thuốc thử nghiệm, bên trái đặt
dung dịch natri clorid 0,9%. Nhúng đều
lƣợng thuốc thử vào gạc đã tiệt trùng có
diện tích 2,5 x 2,5 cm. Áp gạc có thuốc
thử vào vùng da định thử (đã cạo sạch
lông). Cố định miếng gạc trong 4 giờ để
đảm bảo miếng gạc luôn áp vào da thỏ.
Sau 4 giờ, bóc gạc, rửa sạch vùng da
bằng nƣớc cất. Nhận định kết quả sau 4,
24, 48, 72 giờ đắp thuốc.
Đánh giá phản ứng trên chỗ da đặt
thuốc xem mức độ kích ứng gây ban đỏ
hoặc phù theo thang điểm đƣợc quy định
sẵn nhƣ sau:
- Đánh giá phản ứng của da ở trạng
thái gây ban đỏ, có vẩy xƣớc (A).
Không có ban đỏ: 0 điểm; ban đỏ rất nhẹ:
1 điểm; ban đỏ nhận thấy rõ: 2 điểm; ban đỏ
19


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015

vừa phải đến nghiêm trọng: 3 điểm; ban
đỏ có vẩy xƣớc nhẹ: 4 điểm.

3 điểm; phù nề nghiêm trọng (viền phồng
≥ 1 mm): 4 điểm.


- Đánh giá phản ứng của da ở trạng
thái phù nề (B).

- Đánh giá kết quả: lấy trung bình của
2 điểm A và B là điểm kích ứng da của
chế phẩm. Chế phẩm đạt yêu cầu về
độ kích ứng da có điểm kích ứng da
bằng 0.

Không phù nề: 0 điểm; phù nề nhẹ:
1 điểm; phù nề nhẹ có viền phồng:
2 điểm; phù nề vừa phải có viền phồng:

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro.
* Kết quả xác định vòng vô khuẩn trên các chủng VK qu c tế:
Tiến hành đo vòng vô khuẩn khi cho thuốc tiếp xúc với các chủng VK quốc tế.
Bảng 1: Kết quả đo vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên các chủng VK.
VI SINH VẬT

MẪU

D ˉ(mm)

s

VI SINH VẬT

MẪU


D ˉ(mm)

s

Pseu

2

11,02

0,03

SA

2

10,37

0,65

3

9,29

0,21

3

10,91


0,28

4

3,02

0,12

4

10,00

0,41

5

0,00

0,00

5

0,00

0,00

Chuẩn

10,29


0,24

Chuẩn

15,51

0,37

2

11,53

0,38

2

17,04

0,54

3

KK

3

18,72

0,72


4

KK

4

21,27

0,52

5

KK

5

18,83

0,31

Chuẩn

KK

Chuẩn

23,70

0,42


2

14,07

0,21

2

13,03

0,05

3

11,19

0,80

3

13,87

0,33

4

10,63

0,26


4

3,15

0,26

5

8,03

0,05

5

11,27

0,19

Chuẩn

10,43

0,49

Chuẩn

17,00

0,14


2

8,97

0,53

2

14,39

0,29

3

8,80

0,51

3

16,43

0,42

4

8,54

0,04


4

14,20

0,86

5

8,13

0,10

5

9,33

0,24

Chuẩn

12,53

0,23

Chuẩn

25,57

0,45


Pro

Shi

Sal

20

BS

BP

Sar


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015
EC

2

KK

3

BC

2

10,57


0,46

KK

3

8,30

0,20

4

KK

4

11,13

0,09

5

KK

5

0,00

0,00


Chuẩn

17,00

Chuẩn

21,83

0,85

0,82

(Ghi chú: KK: kìm khuẩn).
Dung dịch bào chế có tác dụng trên nhiều chủng VK nhƣ: Shigella flexneri, Salmonella
typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus
subtilis, Bacillus cereus và Sarcina lutea. Trong đó, đáng chú ý là thuốc đều có tác dụng
kháng VK Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus. Đây là 2 chủng VK
hay gặp trên vết bỏng. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu về MA [4, 6]. Ngoài
ra, thuốc chỉ có tác dụng kìm khuẩn đối với VK Escherichia coli, Proteus mirabilis.

Hình 1a: Vòng vô khuẩn trên
Pseudomonas aeruginos.

Hình 1b: Vòng vô khuẩn trên
Staphylococcus aureus.

Hình 1: Hình ảnh vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên một số chủng VK
(Ghi chú: Mẫu chuẩn: Ở vị trí điểm 0 giờ.
Mẫu 2, 3, 4 (từ trái qua phải tính từ mẫu chuẩn): mẫu thử dung dịch MA).

* Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn
trên chủng VK phân lập được tại bệnh viện:
Kết quả xác định vòng vô khuẩn trên
chủng VK phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia:
Lấy mẫu bệnh phẩm từ Khoa Hồi sức
Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia và phân lập
Pseudomonas aeruginosa. Đây là chủng
VK bệnh viện, có khả năng đề kháng cao
với thuốc kháng khuẩn.
* Giá trị vòng vô khuẩn của dung dịch
MA trên Pseudomonas aeruginosa phân
lập tại Viện Bỏng Qu c gia:

Mẫu 1: 5,0 mm; mẫu 2: 7,0 mm; mẫu 3:
7,0 mm.
Nhƣ vậy, dung dịch MA có tác dụng
kháng khuẩn đối với Pseudomonas
aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc
gia. Đáng chú ý, đây là chủng VK gặp tại
khoa Hồi sức Cấp cứu, vì vậy có thể sử
dụng chế phẩm này trong điều trị BN
bỏng nặng với mục đích dự phòng nhiễm
trực khuẩn mủ xanh.
21


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015

Hình 2: Hình ảnh vòng vô khuẩn của dung
dịch MA trên Pseudomonas aeruginosa

phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia.
- Xác định sơ bộ sự phát triển của
Pseudomonas aeruginosa phân lập tại
Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc
ở các nồng độ khác nhau.
Trên thế giới, dung dịch MA 2,5% đƣợc
một số tác giả sử dụng với mục đích đảm
bảo hiệu quả điều trị, góp phần làm giảm chi
phí cho ngƣời bệnh [5]. Để đánh giá hiệu
quả kháng khuẩn của dung dịch MA có
nồng độ < 5%, chúng tôi tiến hành xác
định sơ bộ sự phát triển của chủng trực
khuẩn mủ xanh phân lập tại Viện Bỏng
Quốc gia khi tiếp xúc với các dung dịch
thuốc có nồng độ giảm dần pha chế từ
dung dịch MA 5% ban đầu.

Hình 3b1: Dung dịch MA nồng độ 1/4.

Hình 3b2: Dung dịch MA nồng độ 1/8.

Hình 3c1: Dung dịch MA nồng độ 1/16.

Hình 3a1: Dung dịch MA nồng độ 1/1.

Hình 3c2: Dung dịch MA nồng độ 1/32.

Hình 3a2: Dung dịch MA nồng độ 1/2.
22


Hình 3: Hình ảnh phát triển của Pseudomonas
aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia
khi tiếp xúc với thuốc có nồng độ khác nhau.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015

Khi nồng độ của dung dịch MA 5% giảm,
hiệu quả kháng khuẩn giảm, thậm chí hầu
nhƣ không còn khả năng kháng khuẩn (VK
phát triển xâm kín bề mặt thạch). Điều này
đƣợc lý giải do sức đề kháng của chủng
VK bệnh viện cao và chỉ nhạy cảm với
dung dịch MA 5% đƣợc điều chế ở trên.
2. Kết quả đánh giá tính ích ứng da
trên thỏ thực nghiệm.
Kết quả da trên da lƣng bình thƣờng
của thỏ thực nghiệm.

Hình 4a2: Thời điểm 72 giờ thuốc chứng.

Bảng 2: Điểm đánh giá chỉ tiêu kích ứng
da của dung dịch MA trên thỏ thực nghiệm.

thø tù

®iÓm ban
®á

®iÓm

phï nÒ

®iÓm
trung b×nh

Thỏ 1

0

0

0

Thỏ 2

0

0

0

Thỏ 3

0

0

0

Thỏ 4


0

0

0

Thỏ 5

0

0

0

Thỏ 6

0

0

0

Hình 4b1: Thời điểm 0 giờ thuốc thử.

Dung dịch MA 5% không gây kích ứng
da trên cả 6 thỏ khỏe mạnh. Tuy nhiên,
khi sử dụng trên da bị tổn thƣơng, cần
phải theo dõi tác dụng kích ứng của chế
phẩm này, mặc dù giá trị pH khá trung

tính (khoảng 6,8). Một số hình ảnh của thí
nghiệm thử kích ứng trên da lƣng của thỏ
thực nghiệm đƣợc mô tả ở hình 4.
Hình 4b2: Thời điểm 72 giờ thuốc thử.
Hình 4: Hình ảnh thử tác dụng kích ứng của
dung dịch MA trên da lƣng thỏ thực nghiệm.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi
rút ra một số kết luận:
Hình 4a1: Thời điểm 0 giờ thuốc chứng.

- Dung dịch MA 5% có tác dụng kìm
khuẩn đối với Escherichia coli, Proteus
23


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015

mirabilis. Có tác dụng kháng khuẩn đối
với Shigella flexneri, Salmonella typhi,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis,
Bacillus cereus và Sarcina lutea trên in vitro.
- Dung dịch MA 5% có tác dụng kháng
khuẩn đối với Pseudomonas aeruginosa
phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia trên in
vitro. VK này vẫn phát triển mạnh khi tiếp
xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5%.
- Dung dịch MA 5% không gây kích
ứng trên da lƣng bình thƣờng của thỏ

thực nghiệm.

Viện Bỏng Quốc gia. Tạp chí Y học thảm họa
và Bỏng. 2009, 4, tr.56-62.
2. Lê Đức Mẫn. Nghiên cứu một số yếu tố
nguy cơ và biện pháp điều trị dự phòng nhiễm
khuẩn huyết bỏng tại Viện Bỏng Quốc gia.
Luận án Tiến sỹ Y học. Học viện Quân y. Hà Nội.
2007.
3. Lê Năm và CS. Sơ cứu, cấp cứu và
điều trị bỏng. NXB Y học. 2006.
4. Hashemi B et al. Comparison between
topical honey and mafenide acetate in treatment
of auricular burn. Am J Otolaryngology. 2011, 32,
pp.28-31.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

5. Ibrahim A et al. A simple cost-saving
measure: 2.5% mafenide acetate solution.
J Burn Care Res, online. 2013.

1. Nguy n Như Lâm, Lê Đức Mẫn. Nghiên
cứu căn nguyên nhiễm khuẩn và mức độ
kháng kháng sinh tại Khoa Hồi sức Cấp cứu,

6. Japoni A et al. Pseudomonas aeruginosa:
Burn infection, treatment and antibacterial
resistance. IRC Med J. 2009, 11 (3), pp.244-253.


24



×