Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của một số dược liệu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO
CỦA MỘT SỐ DƢỢC LIỆU
Đỗ Thị Quỳnh Quyên*, Nguyễn Thị Hồng Phúc**, Nguyễn Thị Minh Thuận*, Võ Thị Bạch Huệ*

TÓM TẮT
Mở đầu: Các chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) thường được sử dụng để điều trị Alzheimer.
Nghiên cứu n|y được thực hiện nhằm tìm ra thuốc điều trị Alzheimer tiềm năng với cơ chế ức chế AChE từ dược
liệu góp phần ngăn chặn tiến triển của bệnh.
Phương pháp: Khảo sát tác dụng ức chế AChE trên in vitro của cao chiết cồn 80% từ 12 dược liệu bằng
phương ph{p đo quang Ellman sử dụng cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB trong đĩa 96 giếng ở bước sóng
415nm. Chọn mẫu dược liệu có tác dụng mạnh nhất để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học.
Kết quả: Đề tài chọn được cao toàn phần Dừa cạn có tác dụng ức chế 50,26% ở nồng độ 1mg/ml. Khảo sát
thành phần hóa thực vật của dừa cạn, từ c{c cao ph}n đoạn thu được 3 ph}n đoạn có hoạt tính ức chế enzym
AChE tiềm năng.
Kết luận: Những kết quả này là tiền đề cho những nghiên cứu s}u hơn về hướng tác dụng ức chế AChE của
dược liệu Dừa cạn. Đồng thời có thể dựa vào quy trình sàng lọc đã được x{c định để tiếp tục thử nghiệm trên các

mẫu dược liệu khác nhằm tìm ra dược liệu có tiềm năng cao hơn.
Từ khóa: Ức chế enzym acetylcholinesterase, Dừa cạn, in vitro

ABSTRACT
IN VITRO SCREENING FOR ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITION ACTIVITY
FROM SOME MEDICINAL PLANTS
Do Thi Quynh Quyen, Nguyen Thi Hong Phuc, Nguyen Thi Minh Thuan, Vo Thi Bach Hue
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 235 - 240
Introduction: Acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs) are commonly used for Alzheimer’s treatment. This
research aims to find potential agents from medicinal plants helping prevent progressive Alzheimer's disease.
Methods: Evaluation of the AChE inhibitory activity of alcoholic 80% extracts of 12 plants was performed in
vitro by using Ellman method with acetylthiocholine iodide as substrate and dithiodinitrobenzoic acid as reagent
in 96-well plates at 415 nm. The strongest effectively extracts were taken to investigate its chemical compositions.
Results: The present study demonstrated that total extract of Catharanthus roseus possessed 50,26%
inhibitiory activity at concentration of 1mg/ml. Investigation of the plant composition Catharanthus roseus from
total extract obtained 3 fraction extracts having a potential AChEi activity.
Conclusion: Results are a prerequisite for further studies toward AChEi activity of Catharanthus roseus.
Furthermore, the screening model of AChE inhibitory activity in vitro established could be used for other
medicinal plants to find the higher potential AChEi agents.
Keyword: Acetylcholinesterase inhibitors, Catharanthus roseus, in vitro

*Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dƣợc, Đại học Nguyễn Tất Thành
Tác giả liên lạc: Võ Thị Bạch Huệ ĐT: 0908420240
Email: vothibachhue@gmail.com

Chuyên Đề Dƣợc

235


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của cuộc sống hiện
đại thì sa sút trí tuệ - căn bệnh vẫn đƣợc biết đến
với c{i tên Alzheimer đ ng trở nên phổ biến.
Sinh bệnh học của Alzheimer rất phức tạp liên
qu n đến rất nhiều yếu tố nhƣ myloid bet


Aβ (5), protein tau(9), viêm thần kinh(11), sự tổn
thƣơng củ c{c syn p cũng nhƣ c{c tế bào thần
kinh(3) < Vì thế việc sử dụng các loại thuốc cổ
truyền với nhiều mục tiêu có lẽ sẽ có ƣu thế hơn
so với việc sử dụng một loại thuốc điều trị một
triệu chứng bệnh lý.
Acetylcholin (ACh) có vai trò quan trọng
trong hoạt động của hệ thần kinh, nó là chất dẫn
truyền thần kinh tại khe synap và nồng độ ACh
đƣợc duy trì ổn định bởi enzym
acetylcholinesterase (AChE), một enzym có chức
năng l|m ngƣng lại các hoạt động của chất dẫn
truyền thần kinh ACh thông qua việc thủy phân
ACh tạo thành cholin và acid acetic. Ở các bệnh
nhân Alzheimer, nồng độ ACh bị suy giảm đ{ng
kể(1). Do vậy, các thuốc ức chế AChE đóng v i trò
quan trọng trong việc ngăn chặn sự tiến triển của
bệnh Alzheimer. Các thuốc ức chế cholinesterase
trên thị trƣờng hiện n y đ số là thuốc t}n dƣợc
nhƣng gi{ th|nh thuốc tƣơng đối cao và có
những tác dụng phụ không mong muốn. Nhu
cầu nghiên cứu phát triển các thuốc mới có
nguồn gốc từ dƣợc liệu để hỗ trợ v| điều
trị Alzheimer l| điều cần thiết. Vì vậy nghiên
cứu n|y đƣợc tiến hành nhằm tìm r ph}n đoạn
chiết tiềm năng từ dƣợc liệu góp phần ngăn
chặn tiến triển chứng suy giảm trí nhớ cũng nhƣ
bệnh Alzheimer.

NGUYÊN LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Nguyên liệu
12 dƣợc liệu đƣợc lựa chọn từ kinh nghiệm
dân gian, từ các tài liệu tổng quan về c{c dƣợc
liệu và hoạt chất có tác dụng ức chế AChE đã
đƣợc sàng lọc tại nhiều nƣớc trên thế giới(4,7,10).
C{c dƣợc liệu n|y đƣợc thu thập tại TpHCM và

236

các tỉnh miền Trung Việt Nam theo danh sách
trong bảng 1.
ảng : Danh mục c{c dược liệu được tiến hành khảo
s{t sơ bộ tác dụng ức chế AChE
TT

Tên dược
liệu
Cỏ sữa

Tên khoa học

Họ

Euphorbia thymifolia Euphorbiaceae Toàn cây

Cỏ cứt lợn Ageratum conyzoides
Đan sâm
Dừa cạn
Gùi

Bộ phận
dùng

Salvia miltiorrhiza

Asteraceae

Toàn cây
trên mặt
đất

Lamiaceae

Rễ củ

Cantharanthus roseus Apocynaceae Toàn cây
Willughbeia
Apocynaceae
Dây
cochinchinensis

Khương
Thân rễ
Notopterygium incisum Apiaceae
hoạt
Mần trầu
Poaceae
Toàn cây
Eleusine indica
Muồng hòe Cassia surattensis
Fabaceae

Riềng
Alpinia officinarum Zingiberaceae Thân rễ
Anemarrhena
Tri mẫu
Liliaceae
Thân rễ
asphodeloides
Trinh nữ
Fabaceae
Toàn cây
Mimosa pudica
Xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum
Rutaceae
Vỏ quả

Nguyên liệu đƣợc định danh dựa vào hình
ảnh, tài liệu tham khảo để tránh nhầm lẫn.
Hóa chất
AChE
loại
C3389
(Sigma-Aldrich),
Acetylthiocholin iodid (ATCI) (Sigma-Aldrich),
Acid
5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic
(DTNB)
(Sigma-Aldrich). Các dung môi n-hexan,
chloroform, ethyl cet t EtOAc đạt tinh khiết
phân tích.
Phƣơng pháp nghiên cứu

Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE các mẫu
dược liệu in vitro
Chuẩn bị mẫu: 30g dƣợc liệu khô sau khi xay
nhỏ thành bột đƣợc rây qua rây 2mm và tiến
hành chiết nóng với dung môi là cồn 80%. Dịch
chiết thu đƣợc cô loại dung m i thu đƣợc cao
toàn phần mẫu thử. Pha cao mẫu thử trong
DMSO 10% ở nồng độ 1mg/ml.
Đ{nh gi{ t{c dụng ức chế enzym AChE của
mẫu dƣợc liệu bằng phƣơng ph{p đo qu ng in
vitro dựa trên nguyên tắc củ phƣơng ph{p
Ellman(2): Cơ chất ATCI bị thủy phân bởi enzym
AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản
ứng với thuốc thử acid DTNB tạo thành hợp chất

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

acid 5-thio-2-nitro benzoic có m|u v|ng Cƣờng
độ màu của chất này tỷ lệ thuận với hoạt độ
enzym AChE. Dự v|o độ hấp thu của mẫu thử
đƣợc x{c định ở bƣớc sóng 415nm để đ{nh gi{
khả năng ức chế hoạt tính enzym AChE của
dƣợc liệu.
Hoạt tính ức chế AChE in vitro của mẫu
thử đƣợc x{c định bằng giá trị phần trăm hoạt
tính enzym bị ức chế I% v| đƣợc x{c định
theo công thức:
I% = (1 – AbsT/AbsC) x 100

(CT1)

Trong đó:
I%: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế.
AbsT và AbsC lần lƣợt l| độ hấp thu của mẫu
thử và mẫu chứng.
Mỗi mẫu thử đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần,
mỗi lần làm trên 3 giếng.
Thành phần hỗn hợp phản ứng đƣợc trình
bày ở bảng 2.
ảng : Thành phần hỗn hợp phản ứng đo quang in
vitro
Mẫu Mẫu Mẫu đối
Mẫu trắng
thử trắng chứng
chứng (µl)
(µl) thử (µl)
(µl)

STT

Thành phần

1

Đệm phosphat
pH 8

80

100

2

Mẫu thử

20

20

0

0

3

DMSO 10%

0

0

20

20

4

Enzym AChE
0,25U/ml

20

0

20

0

5

ACTI 2,4mM

40

40

40

40

6

DTNB 2,4mM

Tổng thể tích (µl)

80

100

40

40

40

40

200

200

200

200

Quy trình thử nghiệm đƣợc tóm tắt theo sơ
đồ ở hình 1.
Để có cơ sở đ{nh gi{ hoạt tính ức chế
AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, berberin
clorid đƣợc lựa chọn làm mẫu đối chứng
dƣơng Hợp chất n|y đã đƣợc nghiên cứu
và chứng minh sở hữu hoạt tính ức chế
AChE in vitro khá mạnh. Thực tế, berberin
clorid cũng đã đƣợc sử dụng làm mẫu đối
chứng dƣơng trong một số nghiên cứu(6,8).

Chuyên Đề Dƣợc

ình : Sơ đồ quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế
AChE in vitro
Từ kết quả sàng lọc trên, chọn mẫu dƣợc liệu
có tác dụng cao nhất để tiếp tục khảo sát hóa học
và sàng lọc c{c ph}n đoạn nhỏ có tác dụng dƣợc
lý mạnh nhất trong dƣợc liệu này.
Khảo sát thành phần hóa thực vật của mẫu
dƣợc liệu theo định hƣớng tác dụng ức chế
enzym AChE in vitro

Chiết xuất và phân lập
Dƣợc liệu đƣợc chiết ngấm kiệt với cồn
80% (tỷ lệ dƣợc liệu và dung môi là 1: 15). Sau
khi cô quay thu hồi thu đƣợc cao toàn phần.
Từ cao toàn phần, lắc phân bố với các dung
môi hoặc hỗn hợp dung môi (n-hexan,
chloroform, ethyl cet t để phân tách thành
c{c ph}n đoạn có độ phân cực khác nhau.
Theo dõi qu{ trình t{ch ph}n đoạn bằng sắc
ký lớp mỏng S u đó, ph{t hiện các vết bằng
phƣơng ph{p soi UV ở bƣớc sóng 254nm,
365nm và bằng thuốc thử vanillin – sulfuric
(VS). Sau khi, loại dung m i thu đƣợc các
ph}n đoạn đơn giản. Từ c{c ph}n đoạn này,
tiến hành phân lập bằng phƣơng ph{p sắc ký
cột ch}n kh ng để t{ch th|nh c{c ph}n đoạn
nhỏ hơn
Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE của các
phân đoạn đã phân lập được
Tiến hành khảo sát tác dụng ức chế enzym
AChE củ c{c ph}n đoạn thu đƣợc từ phƣơng

237


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

pháp sắc ký cột ch}n kh ng theo quy trình nhƣ
đối với các mẫu c o dƣợc liệu để chọn ra phân
đoạn có tác dụng cao nhất.

trình theo sơ đồ trong hình 2 và hình 3.

KẾT QUẢ
Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế AChE in
vitro
ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE của
12 dược liệu nghiên cứu
STT

Tên dược liệu
Cỏ sữa
Cỏ cứt lợn
Dừa cạn
Đan sâm
Gùi
Khương hoạt
Mần trầu
Muồng hòe
Riềng
Tri mẫu
Trinh nữ
Xuyên tiêu

% ức chế
9,23
50,26
8,54
2,91
3,67
-

* Ghi chú: (-) không có tác dụng hoặc tác dụng không rõ
ràng

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3 cho thấy trong 12
mẫu dƣợc liệu khảo sát chỉ có 5 mẫu dƣợc liệu có
khả năng enzym ức chế AchE, 7 mẫu dƣợc liệu
không có tác dụng hoặc tác dụng không rõ ràng.
Trong 5 mẫu dƣợc liệu có tác dụng trên in vitro,
Dừa cạn có tác dụng kháng enzym AChE rõ rệt
(50,26%) so với các mẫu còn lại. Vì thế, Dừa cạn
đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát hóa học và phân
lập ph}n đoạn nhỏ có tác dụng mạnh nhất trong
dƣợc liệu này.

ình : Quy trình chiết xuất cao alkaloid toàn phần
từ dược liệu Dừa cạn

Khảo sát thành phần hóa thực vật của cây Dừa
cạn theo định hƣớng tác dụng ức chế enzym
AChE

Chiết xuất và tách phân đoạn
Theo kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật
dƣợc liệu Dừa cạn nhận thấy mẫu dịch chiết cồn
80% có alkaloid là thành phần nổi bật. Vì thế, khi
chiết xuất và phân lập sẽ tập trung vào thành
phần alkaloid củ dƣợc liệu.
Quy trình chiết xuất và xử lý sơ bộ cao
alkaloid toàn phần từ dƣợc liệu Dừa cạn đƣợc

238

ình : Quy trình xử lý sơ bộ cao alkaloid toàn phần
Dựa vào sắc ký lớp mỏng và khối lƣợng các
c o thu đƣợc, chọn cao n-hexan 2 và cao EtOAc 2

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

để tiến hành sắc ký cột chân không.

UV 365

UV 245

Thuốc thử VS

Thuốc thử Dragendorff

ình 4: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra c{c cao ph}n đoạn
Kết quả: Từ cao n-hex n 2 thu đƣợc 8 phân
đoạn nhỏ đƣợc kí hiệu từ H1 – H8. Từ cao
EtOAc 2 thu đƣợc 18 ph}n đoạn nhỏ kí hiệu từ
E1 – E18.

Áp dụng phƣơng ph{p đ{nh gi{ hoạt tính ức
chế AChE in vitro đã đƣợc x{c định để khảo sát
tác dụng củ c{c ph}n đoạn phân lập đƣợc từ
hai cột sắc ký trên. Kết quả đƣợc trình bày ở
bảng 4 và bảng 5.

Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE của các
phân đoạn đã phân lập được
ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AChE của c{c ph}n đoạn cột cao n-hexan 2
Phân đoạn (1mg/ml)
% ức chế
Phân đoạn (1mg/ml)
% ức chế

H1
4,97
H5
30,22

H2
13,15
H6
17,20

H3
6,31
H7
16,74

H4
-7,26
H8
29,90

ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AchE của c{c ph}n đoạn cột cao EtOAc 2
Phân đoạn (1mg/ml)
% ức chế
Phân đoạn (1mg/ml)
% ức chế
Phân đoạn (1mg/ml)
% ức chế

E1
-6,47
E7
23,98
E13
40,24

E2
13,54
E8
19,27
E14
67,26

Nhận xét: Ở nồng độ 1mg/ml, c{c ph}n đoạn
của cao EtOAc 2 cho kết quả ức chế enzym tốt
hơn so với c{c ph}n đoạn của cao n-hexan 2.
Nhƣ vậy c{c ph}n đoạn có độ phân cực trung
bình đến mạnh sẽ có tác dụng dƣợc lý tốt hơn
c{c ph}n đoạn kém phân cực. Trong đó, ph}n
đoạn E17 có kết quả ức chế enzym ở mức khá
c o 78,79% , c{c ph}n đoạn E14 v| E16 cũng cho
kết quả ở mức tƣơng đối (67,26 và 68,45%). Có
h i ph}n đoạn cho kết quả âm có thể là vì dung
môi không thể hòa tan hoàn toàn mẫu làm cho

Chuyên Đề Dƣợc

E3
25,61
E9
25,70
E15
61,97

E4
13,10
E10
16,46
E16
68,45

E5
18,99
E11
22,69
E17
78,79

E6
16,93
E12
35,65
E18
37,16

dung dịch phản ứng bị đục và dẫn tới sai lệch
kết quả.

BÀN LUẬN
Khảo sát tác dụng ức chế AChE trên in
vitro của cao chiết cồn 80% từ 12 dƣợc liệu
bằng phƣơng pháp đo quang Ellman sử dụng
cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB trong đĩa 96
giếng ở bƣớc sóng 415nm. Chọn mẫu dƣợc
liệu có tác dụng mạnh nhất để tiếp tục khảo
sát thành phần hóa học. Đề tài này đã định
hƣớng để tiếp tục khảo sát sâu hơn về cây Dừa

239


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

cạn- là dƣợc liệu đã từ lâu đƣợc biết với các
alkaloid (vincristin; vinblastin) trị ung thƣ vú

KẾT LUẬN
Từ 12 dƣợc liệu sàng lọc đã chọn đƣợc Dừa
cạn có tác dụng ức chế AChE. Phân tích thành
phần hóa học Dừa cạn thu đƣợc 3 ph}n đoạn của
cao EtOAc 2 cho tác dụng ức chế AChE tốt là
E14, E16 v| E17 Trong tƣơng l i có thể tiến hành
nghiên cứu s}u hơn trên dƣợc liệu Dừa cạn và có
thể áp dụng quy trình sàng lọc đã x{c định để
tìm ra một dƣợc liệu mới có tiềm năng ức chế
AChE tốt hơn

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

Auld DS, Kornecook TJ, Bastianetto S, Quirion R (2002).
Alzheimer’s dise se nd the b s l forebr in cholinergic system:
rel tions to β-amyloid peptides, cognition, and treatment
strategies. Progress in neurobiology, 68(3):209-245.
Ellman GL, Courtney KD, Andres V, Featherstone RM (1961). A
new
and
rapid
colorimetric
determination
of
acetylcholinesterase
activity.
Biochemical
pharmacology,
7(2):88IN191-9095.
Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK (1999). The
cholinergic hypothesis of Alzheimer’s dise se:
review of
progress. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry,
66(2):137-147.

240

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

Gholamhoseinian A, Moradi M, Sharifi-Far F (2009). Screening
the methanol extracts of some Iranian plants for
acetylcholinesterase inhibitory activity. Research in pharmaceutical
sciences, 4(2):105.
Hardy J, Allsop D (1991). Amyloid deposition as the central
event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in
pharmacological sciences, 12:383-388.
Hoàng Việt Dũng Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần
hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của hai
loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. Thomsonii và Piper
hymenophyllum Miq., họ hồ tiêu Piper ce e , Đại học Dƣợc Hà
Nội; 2014.
Houghton PJ, Ren Y, Howes M-J (2006). Acetylcholinesterase
inhibitors from plants and fungi. Natural Product Reports,
23(2):181-199.
Min BS, Cuong TD, Lee J-S, Shin B-S, Woo MH, Hung TM
(2010). Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus
buds. Archives of pharmacal research, 33(10):1665-1670.
Mudher A, Lovestone S (2002). Alzheimer's disease–do tauists
and baptists finally shake hands?. Trends in neurosciences,
25(1):22-26.
Mukherjee PK, Kumar V, Mal M, Houghton PJ (2007).
Acetylcholinesterase inhibitors from plants. Phytomedicine,
14(4):289-300.
Shen Z (2004). Brain cholinesterases: II. The molecular and
cellular basis of Alzheimer's disease. Medical hypotheses,
63(2):308-321.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2017

Ng|y b|i b{o được đăng:

15/03/2018

Chuyên Đề Dƣợc



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×