Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
-----------------------

NGUYỄN THỊ NA

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
-----------------------

NGUYỄN THỊ NA


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học:

TS. NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh,
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên
tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành khóa luận. Tôi
xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô tại Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội
2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin trân trọng
cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2. Đặc biệt là
gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập cũng như trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này. Mặc dù đã có nhiều cố
gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất. Tuy nhiên do buổi đầu làm quen
với công việc nghiên cứu khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm
nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý
thầy, cô giáo để khóa luận hoàn chỉnh hơn.
Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Na


LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan: Khóa luận
“Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ môi trường nước vo gạo’’ là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được
thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh. Các kết quả trình
bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong bất kỳ
công trình nào trước đây. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.


Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Na


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................ 1
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................... 2
4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ............................................................ 2
NỘI DUNG ........................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Một vài đặc điểm của CVK.......................................................................... 4
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK .......................................................................... 4
1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ................................................................. 4
1.1.3. Cấu trúc của màng CVK ............................................................................. 5
1.1.4. Một số đặc tính của màng CVK................................................................... 5
1.1.5. Sinh tổng hợp CVK...................................................................................... 6
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng CVK .................................. 6
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc
8
1.2.1. Trên thế giới ................................................................................................ 8
1.2.2. Tại Việt Nam................................................................................................ 9
1.3. Tổng quan về neomycin .............................................................................. 10
1.3.1. Công thức .................................................................................................. 10
1.3.2. Tính chất lí hóa ......................................................................................... 10
1.3.3. Dược lí và dược động học.......................................................................... 11
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ....................................................................... 11
1.4. Tình hình nghiên cứu về neomycin............................................................. 12


1.4.1. Trên thế giới .............................................................................................. 12
1.4.2. Tại Việt Nam.............................................................................................. 12
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 13
2.1. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................... 13
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 13
2.2.1. Phương pháp tạo màng và xử lý màng CVK............................................. 13
2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng neomycin ........................................... 15
2.2.3. Chế tạo màng CVK hấp thụ neomycin ...................................................... 16
2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê...................................................................... 18
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 19
3.1. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường nước vo gạo ............... 19
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường ............................................................ 20
3.3. Tinh chế màng CVK.................................................................................... 22
3.4. Phương trình đường chuẩn neomycin trong PBS ( pH = 7,4 ).................. 23
3.5. Tỉ lệ neomycin hấp thụ vào màng CVK ..................................................... 24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................ 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 29


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A.xylinum:

Acetobacter xylinum

CVK:

Cellulose vi khuẩn

Cs:

Cộng sự

ĐHSP:

Đại học sư phạm

KTNN:

Kỹ thuật nông nghiệp

PBS:

Phosphate buffered saline

NCKH&CGCN:

Nghiên cứu Khoa học và ứng dụng

Nxb:

Nhà xuất bản

mht:

Khối lượng thuốc hấp thụ


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK ....................................................... 5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của neomycin [1]................................................... 10
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tinh chế màng CVK ................................................... 15
Hình 3.1. Màng CVK khi nuôi cấy tĩnh ngày thứ 3 ........................................... 19
Hình 3.2. Màng CVK với thời gian nuôi cấy khác nhau ................................... 21
Hình 3.3. Màng CVK tinh chế.............................................................................. 22
Hình 3.4. Phương trình đường chuẩn của neomycin trong môi trường dung
dịch đệm PBS (pH = 7,4)....................................................................................... 24
Hình 3.5. Màng CVK đang hấp thụ thuốc neomycin ........................................ 25


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ............................................ 4
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng CVK.. 6
Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng CVK ............................. 14
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 ..................................................... 16
Bảng 2.3. Môi trường thử nghiệm cho màng CVK hấp thụ thuốc................... 17
Bảng 3.1. Bảng nồng độ neomycin và giá trị OD277 nm (n = 3)....................... 23
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc neomycin của màng CVK (n = 3) ........... 25
Bảng 3.3. Khối lượng neomycin được hấp thụ, tỷ lệ hấp thụ và cường độ hấp
thụ neomycin của màng CVK (n =3)................................................................... 26


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, Cellulose vi khuẩn (CVK) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng
dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài. Đây là một loại
nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ
phẩm,...Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK được tạo nên từ các nguyên
liệu dẻ tiền, dễ kiếm như nước vo gạo, nước dừa già...,và có thể sản xuất trên quy
mô công nghiệp. Về mặt tính chất CVK có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với
các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định
về kích thước và hướng. CVK còn là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ
nước rất lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề
mặt (lực bền cơ học cao).
Ngày nay, khi môi trường ngày càng bị ô nhiễm thì vấn đề về da cũng xuất
hiện nhiều hơn, như các bệnh viêm da do dị ứng hay viêm da do nhiễm trùng. Để
điều trị bệnh này thì thường có nhiều loại thuốc khác nhau trong đó có Neomycin.
Neomycin là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều trị vết thương. Tuy
nhiên, những phát hiện gần đây cho thấy rằng kem Neomycin thông thường có một
số nhược điểm trong phương pháp điều trị như khả năng thẩm thấu qua da không
cao đạt 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da,…[1].
Để tăng sự hấp thụ của thuốc đồng thời giảm tác dụng không mong muốn
của thuốc, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng hấp
thụ thuốc Neomycin của màng cellulose vi khuẩn từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu: khả năng hấp thụ của thuốc của màng CVK, tìm điều kiện để
màng hấp thụ thuốc được nhiều nhất.
1


3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: khả năng hấp thụ thuốc neomycin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK; thuốc Neomycin dạng chế phẩm và dạng
tinh khiết,...
- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh lý học người và động vật, khoa Sinh
học, Trường ĐHSP Hà Nội, Viện NCKH & ƯD trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu qui trình nuôi cấy Acetobacter xylinum với các nguyên liệu
có sẵn.
- Thu sản phẩm CVK từ môi trường nuôi cấy và xử lý.
- Chế tạo màng CVK sinh học từ CVK thu được, kiểm tra các đặc tính lý
hoá của màng.
- Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
 Ý nghĩa khoa học: tăng thểm hiểu biết về ứng dụng màng CVK
Việc nghiên cứu màng CVK để ứng dụng vào quá trình giảm thiểu tác dụng
phụ của thuốc sẽ mở ra hướng nghiên cứu mới [6],[7]. Từ việc khắc phục nhược
điểm của loại thuốc này sẽ đưa ra một gợi ý cho việc khắc phục nhược điểm của
các loại thuốc khác. Từ đó góp một phần vào sự phát triển của ngành y học.
Trong quá trình nghiên cứu có thể phát hiện ra ưu điểm và nhược điểm
của màng CVK, từ đó sẽ có cách ứng dụng những ưu-nhược điểm của màng một
cách tốt nhất.

2


 Ý nghĩa thực tiễn:
+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng làm màng hấp thụ thuốc định
hướng nhằm khắc phục được những tác dụng phụ không mong muốn trong việc
điều trị các bệnh viêm da bằng thuốc Neomycin.
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Một vài đặc điểm của CVK

1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
- Màng CVK được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn như: Acetobacter,
Achromobacter, Agrobecterium, Pseudomonas,…
- Acetobacter xylinum là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Giống vi
khuẩn A. xylinum sử dụng được lấy từ Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP
Hà Nội 2.
1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phosphor, các yếu tố tăng
trưởng và các yếu tố vi lượng.
Trong đó, nước vo gạo được xem là môi trường thích hợp trong nuôi cấy A.
xylinum. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo được trình bày như trong bảng
1.1.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành Phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6)

30%- 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe (7%- 8%), Zn (12%- 13%)

Acid amin

Leucine, Valine, Lysine

Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước vo
gạo chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích tố tăng trưởng như nhóm
vitamin B1, B3, B5; nhóm khoáng chất như sắt, đồng, kẽm và các acid amin.
4


Nước vo gạo sau khi vo được sử dụng không quá 3 giờ, tránh để cho nước bị
chua làm cho đường, vitamin và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến hiệu
suất kém.
1.1.3. Cấu trúc của màng CVK
Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK giống PC, tuy nhiên chúng khác nhau về
cấu trúc đại thể. Các sợi mới sinh ra của CVK kết lại với nhau để hình thành nên
các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5 nm. Các sợi sơ cấp này kết lại
thành các vi sợi, các vi sợi nằm trong các bó, cuối cùng hình thành các dải. Các dải
có chiều dày 3- 4 nm, chiều rộng 70 – 80 nm; 3,2 x133 nm. Cấu trúc của CVK phụ
thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy [3], [14]. Cấu trúc hóa học được trình bày
trên hình 1.1

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK
1.1.4. Một số đặc tính của màng CVK
Màng cellulose sản xuất bởi các chủng A. xylinum có độ tinh sạch cao với
nguồn gốc thực vật như hemicellulose, pectin và lignin (Kurosumiet al. 2009). Nó
thể hiện tính độc nhất và cấu trúc đặc tính sinh hóa như sợi nano siêu mịn với
cấu trúc mạng (1,5 - nm chiều rộng) [18]. CVK thể hiện độ hấp thụ nước tốt do
cấu trúc mặt lưới của nó cung cấp một diện tích bề mặt lớn đảm bảo cho nó hấp thụ
nước một cách tốt nhất (khoảng 200 lần trọng lượng của nó) [21]. Sản phẩm này có
những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết

5


tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, giữ ẩm tốt, không độc và
không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn mà
không làm thay đổi cấu trúc hay tính chất [13].Với các tính chất này CVK rất phù
hợp để chọn lựa cho ứng dụng hấp thụ thuốc.
1.1.5. Sinh tổng hợp CVK
Cellulose được tổng hợp từ một số nhóm vi khuẩn và đặc biệt là A. xylinum
là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng cacbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý
của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp
với quá trình tạo glucose.
Ngày nay, quá trình tổng hợp cellulose ở A. xylinum gồm nhiều bước liên
tiếp, gồm 2 giai đoạn chính: giai đoạn polyme hoặc giai đoạn kết tinh.
Phương pháp sản xuất CVK: lên men tĩnh và lên men động.
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng
CVK
Nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các
phân tử enzim, axit nucleic, và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, các nguồn
hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống vi sinh vật. Ảnh hưởng
của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất CVK được thể hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng CVK
Nguồn cacbon

Năng suất tổng

Nguốn cacbon

Năng suất tổng

monosaccharide

hợp CVK

disaccharide

hợp CVK

D- Glucose

100

Lactose

16

D- Fructose

92

Maltose

7

D- Galactose

15

Surcrose

33

D- Xylose

11

Cellobiose

D- Arabinose

14

D- Sorbose

11
6

7 – 11


Nguồn nitơ: ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp nguyên liệu cho cơ
thể sinh vật để hình thành nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoaxit,
nucleotit, các bazơ dị vòng [28]. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất với vi sinh vật là NH3
và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu
cơ. Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là pepton, cao
nấm men [23].
Nguồn dinh dưỡng khoáng: Photpho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất
trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật. Photpho có mặt trong hầu hết
các thành phần của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta sử
dụng các nguồn dinh dưỡng photpho vô cơ như K2HPO4, KH2PO4, KNO3,...
Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng ảnh hưởng đến quá trình tạo
màng CVK như Mg, Fe, S, Na, Ca, Mn, Cl,... Một trong số nguyên liệu chủ yếu
ngày nay được sử dụng để tạo màng CVK là nước dừa già, nước vo gạo, dịch hoa
quả, rỉ đường,... nên khi nuôi cấy không cần phải bổ sung nguyên tố vi lượng nữa.
Các chất kích thích sinh trưởng: các vitamin như pyridoxin, axit nicotinic,
biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose,
trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại.
Nước gạo là một trong những thành phần thích hợp để tạo màng CVK vì trong
nước gạo chứa nhiều cacbonhydrat, các vitamin nhóm B, các nguyên tố vi lượng
như Fe, Zn,... và axit amin.
Ngoài ra các điều kiện nuôi cấy như độ pH, nhiệt độ, độ thông khí, thời gian
nuôi cấy,... cũng ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng CVK. Vi khuẩn A.
xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó môi trường nuôi
cấy thu màng CVK cần được bổ sung thêm axit acetic nhằm axit hóa môi trường,
đồng thời nó có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có
hại [22]. Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK là từ khoảng
250C đến 300C. Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm. Nếu nhiệt độ
7


quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào
và hiệu suất lên men sẽ giảm.
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện tiên quyết,
quyết định đến năng suất tạo màng CVK là độ thông khí. Tùy vào thời gian nuôi
cấy để người ta thu được màng với độ dày mong muốn. Thường 24 giờ sau khi
nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng
lên. Sau 36 – 48 giờ sẽ hình thành lớp màng mỏng và ngày càng dày lên.
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc
1.2.1. Trên thế giới
CVK là vật liệu hấp dẫn cho các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực dùng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc.
Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK với một
số loại thuốc đã cho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được một số nhược
điểm của thuốc ở dạng thông thường.
Một trong những ứng dụng y sinh học nổi tiếng nhất của CVK là như một
màng cản khuẩn cho những vết thương hở nghiêm trọng. Các nghiên cứu của một
số tác giả như Fontana và cs (1990) [26]; Czaja và cs (2006) [17], Czaja và cs
(2007) [25] đã chỉ ra CVK có khả năng băng kín vết thương, duy trì dịch tiết, làm
giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào, làm giảm tỉ lệ nhiễm trùng vết thương,
giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm tra. Bên cạnh đó, với vết thương mất da, nhiễm
trùng trên da, CVK đáp ứng được nhu cầu giữ ẩm cho da, tránh da bị khô
Để tăng khả năng giữ ẩm cho da của CVK, một số tác giả nghiên cứu về
lidocaine

[9],

[25],

ibuprophen,

caffeine,

diclofenac,

amoxicillin

[15],

benzalconium chloride [19] và sulfadiazine bạc [16] cho thấy việc bổ sung glycerol
vào màng CVK giúp màng linh động hơn. Tất cả các loại thuốc trên đã được thử
nghiệm invitro cho thẩm thấu qua da và so sánh với cách thức thông thường.

8


Kết quả cho thấy lidocaine hydrochloride (là chất tan trong nước tương tự
như neomycin)
Bên cạnh đó, Luan J. và cs (2012) đã nghiên cứu màng CVK cho băng vết
thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị
vết thương nhiễm khuẩn do bỏng. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng màng CVK
ngâm tẩm bạc sulfadiazine đắp lên vết thương, hoạt động kháng khuẩn đối với
P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi hay dung
dịch thông thường.
Các nghiên cứu thành công của các tác giả nêu trên cho thấy màng CVK có
tiềm năng lớn trong việc làm vật liệu hấp thụ thuốc hiệu quả.
1.2.2. Tại Việt Nam
Tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [2], [3] đã
tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylinum đạt hiệu quả cao.
Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng
dụng màng CVK điều trị bỏng da với 2 loại màng CVK gồm cho thêm hoạt chất tái
sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm
hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng màng thông thường. Tác giả Đinh Thị Kim
Nhung và cs (2012) [7], [8] đã nghiên cứu và chế tạo thành công chế phẩm màng
CVK trị bỏng có tẩm dung dịch berberin clorid 0,1% có tác dụng kháng khuẩn và
tái tạo mô tốt, không gây đau, dị ứng hoặc kích ứng da, không gây rối loạn toàn
thân.
Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh
CVK có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thụ một số loại thuốc. Đây cũng là một
hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển ứng dụng màng CVK trong
việc hấp thụ thuốc neomycin.

9


1.3. Tổng quan về neomycin
Neomycin là loại kháng sinh nhóm aminoglycosid được phát hiện vào năm
1949 từ phòng thí nghiệm của Waksman. Neomycin được sản xuất từmôi trường
nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [1].
1.3.1. Công thức
Tên thông thường: Neomycin
Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) – 5 – amino – 2 – (aminomethyl) – 6 –
[(1R,2R,3S,4R,6S) – 4,6 – diamino – 2 – [(2S,3R,4S,5R) – 4 –[(2R,3R,4R,5S,6S)–
3 – amino – 6 – (aminomethyl) – 4,5 – dihydroxyoxan –2 – yl] oxy – 3 – hydroxy
– 5 – (hydroxymethyl) oxolan – 2 – yl]oxy – 3 –hydroxycyclohexyl] oxyoxane –
3,4 – diol [10].
Công thức phân tử: C23H46N6O13. Khối lượng phân tử: 614.65g/mol.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của neomycin [1]
1.3.2. Tính chất lí hóa
Ở dạng tinh khiết, neomycin có màu trắng hoặc trắng ngà, dễ tan trong nước,
rất khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [10], [15]. Quang phổ hấp
thụ của neomycin ở bước sóng 277nm. Định tính neomycin trong các chế phẩm
10


(thuốc tiêm, thuốc mỡ, viên nén, dung dịch nhỏ mắt,...) sử dụng phương pháp
quang phổ hấp thu hồng ngoại, sắc kí mỏng [18].
1.3.3. Dược lí và dược động học
Neomycin có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương
gây nên các nhiễm khuẩn ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với neomycin như:
S. aureus, E. coli, H. influenzae, ...
Cơ chế hoạt động của neomycin là ức chế sự tổng hợp protein của vi
khuẩn: bằng cách gắn vào protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome làm đọc
sai thông tin của ARN, làm hình thành các protein không có hoạt tính, ngoài ra còn
làm tách các protein ở trạng thái polyme thành monome. Kết quả là vi khuẩn dễ bị
chết do thiếu protein chức năng.
Cơ chế này gồm 4 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Thuốc gắn vào protein là thụ thể chuyên biệt ở trên tiểu đơn vị
30S của ribosome vi khuẩn.
Giai đoạn 2: Thuốc phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên của quá trình
thành lập chuỗi peptit (mARN + formylmethiomine + tARN).
Giai đoạn 3: Thông tin mARN bị đọc sai ở vùng nhận diện của
ribosome, kết quả là một axit amin không phù hợp được đưa vào chuỗi
peptide, tạo một protein không có chức năng.
Giai đoạn 4: Sự gắn của thuốc làm vỡ các polysome thành các
monosome không có khả năng tổng hợp protein, các tác động này xảy ra ít nhiều
có tính đồng thời và kết quả là tế bào vi khuẩn bị chết [20].
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định
Neomycin được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và
mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1]. Neomycin hầu như không hấp
thụ qua đường tiêu hóa (sinh khả dụng đạt 3 – 10% do bị gan phá hủy). Neomycin
không được dùng đường tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của thuốc. Neomycin
11


cũng được khuyến cáo tránh dùng tại chỗ lâu với liều lượng cao vì có thể gây
mẫn cảm trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid
khác [21].
1.4. Tình hình nghiên cứu về neomycin
1.4.1. Trên thế giới
Năm 1949 Selman A. Waksman phát hiện neomycin được sản xuất từ môi
trường nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [14]. Các nhà khoa học trên đã tìm ra
quá trình sinh tổng hợp và đánh giá khả năng kháng khuẩn của neomycin.
Pedersoli W. M. và cs (1994) [14] nghiên cứu về sự hấp thụ của neomycin trên bê
con Hà Lan qua đường tiêm. Kết quả cho thấy neomycin hấp thụ đạt tỷ lệ không
cao, đã bị đào thải qua thận lớn, việc này gây đầu độc cho thận.
Ngoài ra nhóm nghiên cứu của Blanchard C. (2015) [19] cũng chỉ ra rằng
neomycin sulfate cải thiện hoạt động kháng khuẩn của neomycin đơn thuần, do
neomycin sulfate ở dạng muối ít gây dị ứng với cơ thể hơn. Alguacil J. và cs
(2015) [13] cũng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của các dạng thế hệ của
neomycin. Amita H. và cs (2015) [13] nghiên cứu và tìm ra công thức chế tạo gel
chứa neomycin hướng điều trị viêm giác mạc mắt mục đích tăng thời gian cư trú và
cũng duy trì cơ chế giải phóng của thuốc tại mắt. Điều đó giúp tăng cường sinh khả
dạng tại chỗ cũng như hiệu quả giải phóng kéo dài tại chỗ của neomycin trong mắt.
1.4.2. Tại Việt Nam
Neomycin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4
năm 1999 [1]. Neomycin được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một số
hoạt chất khác. Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng màng CVK để hấp thụ thuốc
neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu.

12


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Neomycin (98%) và glycerol (99,5%) được mua từ Trung Quốc.
- Dung môi và chất phản ứng khác được mua từ Đức.
- Màng CV (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi
khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP
Hà Nội 2) lên men trong môi trường nước vo gạo.
- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius – Thụy sỹ); Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; Kính hiển vi điện
tử quét; Buồng cấy vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Máy ép
màng; Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức) kính hiển vi quang học (Carl Zeiss – Đức);
Kính lúp soi nổi STEMI 2000 – C; Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital
Shakergallenkump - Anh); Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu và nhiều dụng cụ hóa
sinh thông dụng khác.
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK: Đường
glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali đihiđrophotphat,
HCl, NaOH, … đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tạo màng và xử lý màng CVK
Quá trình lên men thu màng CVK thô được thực hiện theo các bước sau
[12]:
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1 [5].
- Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường đó ở 1130C trong 15 phút.
- Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia cực tím trong 15 phút
rồi để nguội môi trường.
13


- Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% axit acetic, lắc đều tay cho giống
phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8 ngày ở
260C.
- Bước 6: Thu màng CV thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng CV
Thành phần

Khối lượng

Glucose

30g

Pepton

10g

Diamoni photphat

0,3g

Amoni sulfat

0,5g

Acid acetic

2%

Nước vo gạo

1000ml

Dịch giống A. xylinum

10%

Nguyên liệu nước vo gạo sau khi lọc loại bỏ cặn và tạp chất sau đó
thêm các chất dinh dưỡng cần thiết tạo màng. Hấp tiệt trùng ở 113⁰C, trong 15
phút. Để nguội rồi bổ sung dịch giống và acid acetic. Sau khi ủ tĩnh cho 6 ~ 14
ngày ở 26℃, màng CVK được nhúng vào nước cất trong 2 ngày, và sau đó các
màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình như hình 2.1.


Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
Màng CVK tinh chế
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tinh chế màng CVK
- Tách CVK: trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường [6].
- Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH
3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn.
- Ngâm HCl: màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi ép màng.
Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH [6].
- Ngâm nước: màng sau khi ngâm bằng HCl rửa nước rồi ép màng. Ngâm
nước để trung hòa hết acid trong thời gian 48 giờ ta thu được CVK tnh khiết.
- CVK sau khi được tinh chế, ép loại bỏ bớt nước.
2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng neomycin
- Nguyên tắc: sử dụng máy đo quang phổ UV - Vis 2450 để đo các mẫu
dung dịch chuẩn (6 mẫu) ở bước sóng 277nm.


- Pha thuốc neomycin ở các nồng độ là: 0,05mg/ml, 0,1mg/ml,
0,15mg/ml,
0,2mg/ml, 0,25mg/ml, 0,3mg/ml
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo cường độ quang
phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 277nm trong các dung dịch
mẫu chuẩn [6].
- Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn neomycin bằng phần
mềm Excel 2013.
- Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần và
đo quang phổ 3 lần, lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
2.2.3. Chế tạo màng CVK hấp thụ neomycin
2.2.3.1. Chuẩn bị bộ đệm
Môi trường đệm Photphat buffered saline (PBS) [5] được chuẩn bị với các
thành phần và cách pha được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4
Hóa chất
Thành phần

Cách pha
Khối lượng

NaCl

0,8g

KCl

0,2g

Na2HPO4

1,44g

KH2PO4

0,24g

Cho hóa chất vào cốc
đong.
Thêm đến mức 800ml
bằng nước cất.
Điều chỉnh pH tới 7,4
bằng HCl.
Bổ sung nước tới
1000ml.
Khử trùng.


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×