Tải bản đầy đủ

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH và xác ĐỊNH HOẠT TÍNH của PROTEIN KOD DNA POLYMERASE tái tổ hợp ở e COLI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA
PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA
PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8420101.21


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Văn Sáng

Hà Nội – Năm 2019


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Sáng,
bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, trường Khoa học tự nhiên, người đã hướng
dẫn, giúp đỡ và tận tình chỉ bảo tôi. Tôi cũng cảm ơn thầy vì đã cho tôi có cơ hội
được làm việc trong nhóm của thầy, giúp tôi học tập được nhiều điều và có niềm
đam mê với khoa học.
Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Nguyễn Thị Thu Huyền và anh
Lê Tuấn Anh, học viên cao học, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, trung
tâm khoa học sự sống đã luôn giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập
cũng như quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm.
Tôi cũng xin được cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Di truyền học,
PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, TS. Đỗ Thị Phúc, TS. Trần Đức Long, ThS. Trần
Thùy Anh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc tại trường.
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ
Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN 02-2016 58”
Nghiên cứu có sự hợp tác và hỗ trợ cung cấp gen mã hóa bởi công ty
TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, chia sẻ
và động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 12 năm 2019
Học viên

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
MỤC LỤC ..................................................................................................................ii


DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ...................................................... vi
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
1.1.

Tổng quan về PCR ............................................................................................ 3

1.1.1.

Giới thiệu ....................................................................................................... 3

1.1.2.

Ứng dụng của PCR ........................................................................................ 3

1.1.1.

Nguyên lý ...................................................................................................... 5

1.1.2.

Thành phần phản ứng PCR ............................................................................ 6

1.2.

Giới thiệu về DNA polymerase ........................................................................ 7

1.2.1.

Giới thiệu chung ............................................................................................ 7

1.2.2.

Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein .................................... 7

1.2.3.

Các loại DNA polymerase thương mại ......................................................... 7

1.2.4.

Cấu trúc của DNA polymerase ...................................................................... 9

1.3.

KOD DNA polymerase ................................................................................... 10

1.3.1.

Giới thiệu về KOD....................................................................................... 10

1.3.2.

Đặc điểm và cấu trúc ................................................................................... 11

1.4.

Lựa chọn hệ thống biểu hiện ........................................................................... 12

1.4.1.

Vật chủ biểu hiện ......................................................................................... 12

1.4.2.

Vector .......................................................................................................... 13

1.5.

Phương pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực ................................................. 16

1.5.1.

Sắc ký ái lực Nickel ..................................................................................... 17

1.5.2.

Sắc ký ái lực Glutathione............................................................................. 18

Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 20
1.1.

Vật liệu và hóa chất ......................................................................................... 20

1.1.1.

Vật liệu ........................................................................................................ 20

1.1.2.

Hóa chất ....................................................................................................... 20

1.1.3.

Dụng cụ và thiết bị....................................................................................... 21
ii


2.2.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 22

2.2.1.

Nhân dòng gen KOD ................................................................................... 22

2.2.2.

Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD ................................................... 23

2.2.3.

Biểu hiện protein tái tổ hợp ......................................................................... 26

2.2.4.

Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực ...................................................... 26

2.2.5.

Thẩm tách protein ........................................................................................ 28

2.2.6.

Thử hoạt tính enzyme .................................................................................. 29

2.2.7.

Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 29

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 30
3.1.

Nhân dòng gen KOD ...................................................................................... 30

3.1.1.

Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD ...................................................... 30

3.1.2.

Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR ................................................ 30

3.1.3.

Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vectơ biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1. 31

3.1.4.

Kết quả tách chiết plasmid DNA ................................................................. 33

3.1.5.

Giải trình tự plasmid .................................................................................... 34

3.2.

Biểu hiện protein tái tổ hợp............................................................................. 35

3.3.

Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực .......................................................... 37

3.3.1.

Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel ......................... 37

3.3.2.

Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST............................. 41

3.4.

Thẩm tách protein ........................................................................................... 41

3.5.

Thử họat tính enzyme ..................................................................................... 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 46

iii


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [4] .........11
Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng..........................................................20
Bảng 3: Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................21
Bảng 5: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn .................................................24
Bảng 6: Thành phần phản ứng nối ............................................................................24
Bảng 7: Kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba sử dụng GenScript ................................30

iv


DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Ứng dụng của kỹ thuật PCR [11] ...................................................................4
Hình 2: Nguyên lý nhân bản DNA qua các chu kỳ nhiệt [16] ....................................5
Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [35] ...........................................6
Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [39].............................................9
Hình 5: Cấu trúc của KOD DNA polymerase [15] ...................................................12
Hình 6: Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống pET ở tế bào E. coli BL21 (DE3) [9]...13
Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện pET-32a ..............................................................15
Hình 8: Cấu trúc vector biểu hiện pGEX-4T-1 .........................................................15
Hình 9: Các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực ...................................16
Hình 10: Cơ chế tinh sạch của phương pháp sắc ký ái lực với Nickel [27]..............18
Hình 11: Cơ chế của phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST [21] ........................19
Hình 12: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu .................................................................22
Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen KOD từ vector pUC19-KOD ............31
Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M và KOD-pGEX-4T-1 vào tế
bào E. coli BL21 DE3. ..............................................................................................32
Hình 15: Kết quả PCR khuẩn lạc ..............................................................................33
Hình 16: Kết quả điện di plasmid .............................................................................34
Hình 17: Kết quả PCR kiểm tra plasmid...................................................................34
Hình 18: So sánh trình tự axit amin của KOD với trình tự KOD gốc ......................35
Hình 19: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi 6xHis ở tế bào BL21 ............................36
Hình 20: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi GST ở tế bào BL21 ..............................37
Hình 21: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ...........................................................38
Hình 22: Kết quả tối tinh sạch KOD-His kết hợp với biến tính bằng nhiệt ..............39
Hình 23: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính. ........................40
Hình 24: Kết quả tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính và không biến tính. .....40
Hình 25: Kết quả tinh sạch KOD-GST. ....................................................................41
Hình 26: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His .....................................42
Hình 27: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-GST ...................................43
Hình 28: Kết quả PCR thử hoạt tính enzyme KOD-His và KOD-GST với các kích
thước gen và đệm PCR khác nhau. ...........................................................................44

v


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Tên đầy đủ

Kí hiệu
APS

Ammonium Persulfate

Aa

Axit amin

BSA

Bovine serum albumin

Bp

Base pair

DNA

Axit deoxyribonucleic

DTT

Dithiothreitol

dNTPs

Deoxynucleoside triphosphates

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli

Escherichia coli

GST

Glutathione S-transferase

IMAC

Immobilized metal affinity chromatography

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base pair

LB

Luria-Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Axit ribonucleic

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Điện di polyacrylamide với SDS

TAE

Tris – acetic EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

vi


MỞ ĐẦU

KOD DNA polymerase là enzyme có hoạt tính tốt trong số các DNA
polymerase đang được sử dụng hiện nay. KOD DNA polymerase có vai trò quan
trọng và được ưu tiên sử dụng trong PCR khuếch đại các sản phẩm gen kích
thước lớn, giải trình tự hệ gen, hay nghiên cứu đột biến và tổng hợp gen. Do đó,
enzyme này đang được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh, y học, lĩnh
vực pháp y, khoa học hình sự và nông nghiệp như: xét nghiệm sinh học phân tử
để chuẩn đoán các bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, phát hiện mầm mống gây
ung thư…
Trên thị trường hiện nay, KOD DNA polymerase đang được cung cấp
bởi công ty TOYOBO Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma của Mỹ với các đặc tính
ưu việt như tần số đột biến thấp, tính ổn định cao, và tốc độ kéo dài rất nhanh. Tuy
nhiên việc nhập khẩu hoàn toàn từ các công ty nước ngoài kèm theo những vấn đề
không mong muốn cho người sử dụng khi như (1) giá thành cao, (2) thời gian vận
chuyển kéo dài lâu, (3) chất lượng enzyme có thể bị ảnh hưởng do điều kiện bảo
quản không đảm bảo trong thời gian vận chuyển.
Xuất phát từ thực tiễn nhu cầu enzyme KOD DNA polymerase trong các
phòng thí nghiệm cũng như các công ty công nghệ sinh học ở Việt Nam là rất lớn.
Để đảm bảo tính chủ động trong nghiên cứu và làm chủ về mặt công nghệ, Việt
Nam cần có quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase đạt chất lượng tốt và giá
thành rẻ hơn.
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về DNA polymerase, tuy
nhiên số lượng công bố liên quan đến quá trình tinh sạch KOD DNA polymerase tái
tổ hợp vẫn còn rất hạn chế. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất nghiên cứu “Nhân
dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase
tái tổ hợp ở E. coli” với mục tiêu tạo ra KOD DNA polymerase tái tổ hợp bằng
phương pháp đơn giản, từ đó có thể sản xuất lượng lớn enzyme này, làm chủ về mặt
công nghệ ở Việt Nam.

1


Căn cứ vào mục tiêu chính của đề tài, chúng tôi đề ra các mục tiêu cụ thể
như sau:
1. Tối ưu hóa được mã bộ ba của gen KOD DNA polymerase bằng công cụ
tin sinh.
2. Tổng hợp và nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA polymerase.
3. Chèn đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase vào vectơ biểu hiện
pET-M và pGEX-4T-1.
4. Biểu hiện protein KOD tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 DE3.
5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột Niken
hoặc GST.
6. Đánh giá hoạt tính enzyme KOD bằng kỹ thuật PCR.

2


Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về PCR
1.1.1. Giới thiệu
Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là kỹ thuật trong sinh học phân tử được sử
dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa,
tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của trình tự DNA đó. Quá trình PCR có thể
khuếch đại không chỉ những đoạn DNA có kích thước ngắn khoảng vài trăm bp mà
còn có thể khuếch đại những đoạn lên tới 10 kb. Đặc biệt, khi sử dụng các DNA
polymerase tái tổ hợp phản ứng PCR còn có thể khuếch đại các đoạn có kích thước
lên đến 70 kb [2].
Phản ứng PCR được giới thiệu và phát triển trong ống nghiệm bởi một nhà
khoa học người Mỹ, Kary Mullis, năm 1985 [30]. Kỹ thuật PCR nguyên thủy của
K. Mullis sử dụng enzyme DNA polymerase không chịu nhiệt từ vi khuẩn E. coli
[30]. Do đó, việc thực hiện phản ứng còn khó khăn khi phải bổ sung enzyme
polymerase vào mỗi chu kỳ phản ứng. Cho đến nay, để trở thành một công cụ
không thể thiếu trong phòng thí nghiệm sinh y học, đã có những tiến bộ kỹ thuật
đóng góp làm cho kỹ thuật PCR nguyên thủy trở thành kỹ thuật PCR khá đơn giản
và hiệu quả. Sự thay đổi đầu tiên phải kể đến việc phát hiện và sản xuất được các
enzyme polymerase chịu nhiệt. Năm 1988, lần đầu tiên phân lập được enzyme bền
nhiệt, Taq polymerase, đã đơn giản hóa được quá trình PCR và đưa PCR thành phản
ứng tự động [29]. Kể từ đó, có rất nhiều ứng dụng được phát triển dựa trên phản
ứng PCR. Tiếp sau đó là việc chế tạo được các máy luân nhiệt hoạt động hiệu quả
và chính xác hơn. Hiện nay, các máy PCR đều được thiết kế gọn nhẹ hơn, có nhiều
chức năng hơn, kể cả chức năng gradient – chức năng thực hiện nhiệt độ gắn mồi
thay đổi tuyến tính trên các giếng ủ nhiệt.
1.1.2. Ứng dụng của PCR
Kỹ thuật PCR đã được khai thác và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau (Hình 1) [11].
(1) PCR ứng dụng trong công nghệ gen: nhờ có PCR mà việc có được gen
mong muốn thực hiện một cách dễ dàng và trong thời gian rất ngắn có thể chỉ trong

3


một vài ngày, thay vì phải cần rất nhiều thời gian như khi chứa có công cụ PCR.
Chính vì vậy, hiện nay công nghệ gen đã có nhiều tiến bộ đáng kể qua các sản phẩm
protein được sản xuất và đưa vào sử dụng trong y học, dược phẩm hay nông nghiệp
[16].
(2) PCR ứng dụng trong y học: Ngoài ra PCR cũng đóng vai trò trong việc
phát hiện và sàng lọc các bệnh lý di truyền. Việc phát hiện các bệnh di truyền trong
một gen nhất định là một quá trình lâu dài và khó khăn, quá trình này đã được rút
ngắn nhờ sử dụng kỹ thuật PCR. Mỗi gen sẽ được khuếch đại và phân tích trình tự
xác định đột biến hay những thay đổi gây bệnh di truyền, hoặc còn có thể phát hiện
các bệnh do các tác nhân vi sinh vật gây ra bằng phương pháp PCR khuếch đại
DNA của virus, vi khuẩn [17].
(3) PCR ứng dụng trong pháp y: PCR cũng là một công cụ hiệu quả trong
giám định pháp y để xác định tông tích nạn nhân, xác định thủ phạm qua những dấu
vết sinh học để lại tại hiện trường; xác định quan hệ huyết thống qua dấu vân tay di
truyền; và xác định hài cốt lâu năm… nhờ có kỹ thuật PCR mà các dấu vết DNA
muốn tìm trong các mẫu được khuếch đại và phân tích [11].
(4) PCR ứng dụng trong giải trình tự: Có thể nói PCR đã thúc đẩy sự phát
triển của công nghệ giải trình tự. Nhờ có PCR mà các nhà khoa học đã thay đổi
phương pháp giải trình tự Sanger thành phản ứng chu kỳ nhiệt giúp giải trình tự với
hiệu quả tốt và nhạy hơn rất nhiều [11] .

Hình 1: Ứng dụng của kỹ thuật PCR [11]

4


1.1.3. Nguyên lý
Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm
nhiệt độ để biến tính và tái bản DNA. Mỗi chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm ba giai đoạn
nhiệt độ (Hình 2): (1) đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 95°C để phá vỡ các liên kết
hydro của mạch đôi DNA, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn (
giai đoạn biến tính). Thời gian để biến tính tùy thuộc vào kích thước của khuôn,
thường sẽ từ 1 – 5 phút. (2) Tiếp theo, nhiệt độ sẽ được hạ đến 45°C - 65°C, đây là
khoảng nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến và bắt cặp bổ sung vào hai đầu
của mạch đơn DNA đích (giai đoạn bắt cặp). Nhiệt độ và thời gian gắn mồi phụ
thuộc vào thành phần base, độ dài và nồng độ của mồi. Đối với một số loại khuôn
và mồi, sự chênh lệch rất nhỏ giữa nhiệt độ gắn mồi từ 1°C – 2°C cũng ảnh hưởng
đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Với những mồi có nhiệt độ nóng chảy trên
65°C có thể kết hợp giai đoạn gắn mồi và kéo dài thành chu kỳ PCR có hai bước.
(3) Cuối cùng, 72°C là nhiệt độ thích hợp để enzyme DNA polymerase tổng hợp
mạch bổ sung với DNA đích. Thời gian kéo dài tùy thuộc vào kích thước đoạn gen
muốn nhân bản và loại DNA polymerase được sử dụng. Thời gian kéo dài 1 phút
thường đủ cho sản phẩm gen có kích thước dưới 2 kb. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một
DNA đích được nhân bản thành hai bản sao, với chu kỳ được lặp lại nhiều lần liên
tục 30 đến 40 lần thì sẽ có hàng tỷ bản sao được tạo ra.

Hình 2: Nguyên lý nhân bản DNA qua các chu kỳ nhiệt [16]
5


1.1.1. Thành phần phản ứng PCR
Để thực hiện được phản ứng PCR trong ống nghiệm, cần có điều kiện thích
hợp để DNA polymerase có thể thực hiện. Các thành phần chính để thực hiện phản
ứng PCR được mô tả trong Hình 3, phản ứng cần có dNTPs, các oligonucleotide mở
đầu (primer-mồi), enzyme DNA polymerase và các điều kiện phản ứng khác thích
hợp với enzyme. Phản ứng cần có dNTPs bao gồm khoảng 200 µM mỗi loại
Adenosine - , Thymidine - , Guanosine - , Cytosine – triphosphate [35].

Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [35]
Mồi (primers) là những đoạn oligonucleotides dài khoảng 18-30 bases
mang nhóm 3’–OH tự do và có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA cần
được nhân bản [19]. Mồi được bắt cặp bổ sung với khuôn DNA ở điểm khỏi đầu và
kết thúc, giúp DNA polymerase có thể nối và tổng hợp sợi đơn DNA mới. Sự lựa
chọn chiều dài và trình tự mồi phụ thuộc ba yếu tố. Đầu tiên đó là nhiệt độ nóng
chảy (biến tính) của mồi, đây là nhiệt độ mà trên nó thì mồi sẽ tách ra khỏi mạch
khuôn DNA. Nhiệt độ nóng chảy của mồi thường khoảng từ 60-75 °C. Thứ hai đó
là hàm lượng GC trong mồi, thường thì hàm lượng GC nên trong khoảng từ 4060%. Ở hàm lượng này, nhiệt độ biến tính của mồi sẽ không quá cao, vì có thể sẽ
ảnh hưởng đến hoạt động của DNA polymerase. Nhiệt độ nóng chảy của các mồi
nên gần nhau, có thể chênh lệch nhau nhưng không quá 5°C. Yếu tố cuối cùng đó là
việc hình thành cấu trúc kẹp tóc, hay tự bắt cặp của các mồi, điều này cũng có thể
ảnh hưởng đến chất lượng của phản ứng PCR [6].

6


Hỗn hợp phản ứng trong môi trường đệm Tris-HCl có pH từ 7.5 – pH 8.8,
KCl, 500 – 1000 µg/ml gelatin hoặc BSA, 0.5 – 5.0 mM MgCl2 (MgCl2 là cofactor
của DNA polymerase). Ngoài ra cũng có thể bổ sung hàm lượng thấp cho số chất
khử như Triton X-100, Tween-20, dimethylsulphoxide (DMSO) để làm tăng tính
đặc hiệu của mồi [35].
Cuối cùng, quan trọng nhất là DNA polymerase được sử dụng để tổng hợp
lên mạch DNA mới. Các loại DNA polymerase thương mại dùng trong phản ứng
PCR đều có tính bền nhiệt, nhưng khác nhau ở khả năng đọc sửa, độ chính xác và
hiệu suất [35].
1.2. Giới thiệu về DNA polymerase
1.2.1. Giới thiệu chung
Năm 1956, Arthur Kornberg phát hiện ra DNA polymerase I ở Escherichia
coli, đây là enzyme đầu tiên được xác định liên quan đến quá trình nhân đôi DNA
[10]. Nguyên lý cơ bản về chức năng của DNA polymerase đó là sao chép một đoạn
DNA sử dụng một mạch làm khuôn mẫu và một đoạn DNA hay RNA có kích thước
nhỏ làm mồi cho quá trình sao chép và tổng hợp từ đầu 5’ đến đầu 3’-OH. DNA
polymerase đóng vai trò tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các
monodeoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) [32].
1.2.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein
Dựa trên trình tự protein tương đồng, DNA polymerase được chia thành 5
họ chính đó là Escherichia coli DNA polymerase I (họ A), DNA polymerase II (họ
B), DNA polymerase III (họ C), và những loại khác (họ X) [28]. Các loại DNA
polymerase khác nhau có thể tìm thấy ở các sinh vật khác nhau. Ví dụ như DNA
polymerase I, II, III được tìm thấy ở E. coli hoặc ở các sinh vật nhân thực có thể tìm
thấy cả năm loại DNA polymerase (DNA Pol α, β, γ, δ, ε).
1.2.3. Các loại DNA polymerase thƣơng mại
Hiện nay, các DNA polymerase sử dụng trong phản ứng PCR hầu hết là các
polymerase tái tổ hợp. Các DNA polymerase thương mại này có nguồn gốc từ các
loài khác nhau sẽ có sự khác biệt về cấu trúc, đặc tính như là hiệu suất, độ chính xác
do khả năng đọc sửa hay tỉ lệ kéo dài chuỗi polynucleotit. Các loại polymerase

7


thường được sử dụng cho phản ứng PCR được thu nhận từ các vi sinh vật bền nhiệt
như

Thermus

aquaticus

(Taq),

Pyrococcus

furiosus

(Pfu

polymerase),

Thermococcus litoralis (Tli polymerase), Thermus thermophiles (Tth polymerase)
và Thermococcus kodakaraensis (KOD polymerase) [10]. Việc lựa chọn
polymerase phụ thuộc vào mục đích, loại phản ứng PCR được thực hiện và kích
thước của đoạn gen.
Vai trò của DNA polymerase trong việc sao chép, tổng hợp và sửa chữa phụ
thuộc vào một số đặc tính enzyme quan trọng của polymerase. Chúng được đánh
giá dựa trên các đặc điểm đó là độ đặc hiệu (specificity), tính bền nhiệt
(thermostability), hiệu suất (processivity), và độ chính xác (fidelity) [32].
Độ đặc hiệu (specificity)
Khuếch đại không đặc hiệu là một trong những trở ngại lớn trong phản ứng
PCR, vì nó ảnh hưởng đến năng suất và độ nhạy của việc khuếch đại gen đích. Nếu
DNA polymerase có độ đặc hiệu kém thường có thể tạo dimer của mồi hay mồi bám
không đặc hiệu trong phản ứng PCR. Để DNA polymerase có độ đặc hiệu tốt hơn
nên để enzyme trên đá hoặc bổ sung DNA polymerase ở bước gắn mồi.
Tính bền nhiệt (thermostability)
Tính bền nhiệt của DNA polymerase là đặc điểm chính cho phép phản ứng
PCR lặp đi lặp lại qua các chu kỳ để khuếch đại các đoạn DNA, do đó đây là một
đặc tính quan trọng của DNA polymerase. Khả năng chịu nhiệt của enzyme liên
quan đến kết quả của phản ứng PCR qua các chu kỳ.
Hiệu suất (processivity)
Hiệu suất của PCR số nucleotide trung bình được thêm vào bởi DNA
polymerase trong một lần enzyme bám vào khuôn. Hiệu suất tổng hợp của mỗi
enzyme quyết định thời gian tổng hợp một đoạn DNA của Polymerase đó. Một
enzyme được cho là có hiệu suất nếu nó duy trì sao chép được một đoạn khuôn dài
mà không bị gián đoạn. Hiệu suất của một enzyme có thể được xác định dựa trên
những đặc điểm sau: polymerase trap hay tỉ lệ phản ứng bị giới hạn (Limited
reaction rate)[25].

8


Độ chính xác hay tỉ lệ đột biến (fidelity hay error frequency)
Độ chính xác là một trong những đặc tính quan trọng của polymerase, nó
ảnh hưởng đến trình tự đoạn DNA được khuếch đại. DNA polymerase có độ chính
xác càng cao thì khả năng đột biến trong quá trình tổng hợp mạch DNA mới càng
thấp. Độ chính xác của phản ứng PCR phụ thuộc vào hoạt tính của vùng 5’- 3’
exonuclease của DNA polymerase, đây là vùng có chức năng đọc sửa trong quá
trình tổng hợp sợi DNA mới.
1.2.4. Cấu trúc của DNA polymerase
Hiện nay, rất nhiều loại DNA polymerase đã được khám phá. Tuy có các
trình tự axit amin khác nhau nhưng tất cả các loại DNA polymerase đều có một cấu
trúc chung giống bàn tay phải (Hình 4) bao gồm ba phần được gọi là palm (lòng bàn
tay), thumb (ngón tay cái) và fingers (ngón tay). Trong đó, cấu trúc của vùng
fingers và thumb là khác nhau, còn vùng palm lại tương đồng giữa các loại khác
nhau [39]. Trình tự bảo thủ ở vùng palm đóng vai trò là trung tâm hoạt động (là
vùng liên kết với kim loại hóa trị 2 thường là Mg2+), với cấu trúc bao gồm 2 chuỗi
xoắn α gấp chồng lên nhau và chồng lên gấp β [39]. Vùng fingers giúp xác định
chính xác vị trí của khuôn ở trung tâm hoạt động, trong khi đó vùng thumb có liên
quan đến việc bám của DNA và đóng vai trò trong hiệu suất của enzyme[39].

Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [39]

9


1.3. KOD DNA polymerase
1.3.1. Giới thiệu về KOD
KOD DNA polymerase thuộc họ DNA polymerases B hay còn gọi là αDNA polymerase vì nó có trình tự axit amin bảo thủ với DNA polymerase α ở sinh
vật nhân thực. KOD được tìm thấy ở vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus
kodakarensis hay còn có tên khác là Pyrococcus kodakarensis. Loại vi khuẩn này
được phân lập từ khu vực hồ nước nóng gần miệng núi lửa, ở đảo Kodakara,
Kagoshima, Nhật Bản [23]. Vi khuẩn này là sinh vật biển, sống trong môi trường kỵ
khí, dị dưỡng và chịu nhiệt cao (lên đến 95°C).
Tương tự như một số loại enzyme họ B khác, ví dụ như Pfu được phân lập
từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus, thì KOD được sử dụng trong các phản ứng PCR,
đặc biệt là đối với việc khuếch đại các đoạn DNA dài. Trên thực tế, hoạt tính của
KOD DNA polymerase và khả năng ứng dụng của enzyme này trong phản ứng PCR
đã được chứng minh trong rất nhiều công bố [22, 34]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra
rằng KOD là polymerase có tính bền nhiệt rất tốt, độ chính xác cao nhờ khả năng
đọc sửa của vùng 3’ – 5’ exonuclease [33], điều này giúp KOD có sự vượt trội so
với Taq và Pfu DNA polymerase. Cụ thể, qua các số liệu ở Bảng 1 đã cho thấy,
KOD có tỉ lệ kéo dài cao gấp đôi (6-8 kb/phút), số lượng nucleotide trong 1 lần bám
của enzyme (>300 base) cao gấp 5 lần so với Taq (50-60 base) và 15 lần so với Pfu
(15-20 base). Hơn nữa KOD còn có vùng 3’-5’ exonuclease có khả năng đọc sửa,
khiến tỉ lệ đột biến của nó rất thấp giống như ở Pfu đó là 0.38% [33]. Nhiệt độ tối
ưu của KOD DNA polymerase là 75°C, tương tự như Pfu [33]. Đặc biệt, KOD
DNA polymerase còn có tính bền nhiệt cao hơn gấp khoảng 20 lần so với Taq
polymerase ở 95°C. Do vậy, KOD DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trong
các hệ thống PCR yêu cầu nhanh, độ chính xác cao như các phản ứng PCR tạo đột
biến, nhân dòng gen hay PCR phát hiện đột biến gây bệnh. (Ví dụ như TOYOBO
Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma của Mỹ đã đưa vào sản xuất là enzyme thương
mại).

10


Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [3]
AmpliTaq

Pfu

KOD

Tốc độ kéo dài chuỗi

2-4 kb/phút

2-4 kb/phút

6-8 kb/phút

Processivitya

50-60 nu

15-20 nu

>300 nu

3’-5’ Exonuclease activityb

Không





Terminal transferase activityc



Không

Không

Độ chính xácd

98.7%

99.61%

99.62%

a

Processivity: số nucleotide đƣợc kéo dài trong một lần polymerase bám vào

khuôn
b

Khả năng đọc sửa của enzyme

c

TTA kết quả sự adenyl hóa của đầu 3’của mạch mới tổng hợp

d

Độ chính xác của enzyme. Một enzyme có độ chính xác là 1.3% sẽ có 1.3

nucleotide trong 100 không đúng.
1.3.2. Đặc điểm và cấu trúc
KOD DNA polymerase gồm 774 axit amin, tương tự như cấu trúc chung
của các DNA polymerase khác, KOD cũng gồm có các phần của polymerase là
palm, thumb và finger. Nghiên cứu của Hashimoto và cộng sự năm 2001 đã chỉ ra
cấu trúc của KOD DNA polymerase bao gồm các domain đã biết [14] và các
subdomain như mô tả ở Hình 5. Theo đó, KOD bao gồm vùng N-terminal (kí hiệu
N-ter gồm aa từ 1-130 và 327-368, màu tím), vùng có chức năng giúp polymerase
này đọc sửa là exonuclease (kí hiệu Exo gồm aa từ 131-326, màu xanh), và vùng
polymerase (Pol). Vùng Pol này bao gồm subdomain Palm (aa 369-449, 500-587,
màu nâu), Finger (450-499, màu xanh lá) và domain Thumb gồm thumb-1 và
thumb-2 (588-774, màu đỏ) [15]. Khác biệt của KOD DNA polymerase so với cấu
trúc của các Polymerase họ A, cụ thể là cấu trúc Thermus aquaticus DNA
polymerase I đã được công bố năm 1998 bởi Ying .L và cộng sự [18]. Qua đó, ở
Taq DNA polymerase các axit amin cơ bản của vùng finger có vai trò giữ nhóm
phosphate của các dNTPs đến và vùng khác của finger gây ra sự thay đổi về hình
dáng để vận chuyển các nucleotide đến trung tâm hoạt động. Đối với KOD DNA
polymerase thì vùng finger lại bao gồm 2 chuỗi xoắn dài không giống như cấu trúc

11


của DNA pol I. Do đó, ở KOD DNA polymerase, sự di chuyển của vùng pol để vận
chuyển dNTP đến trung tâm hoạt động khác so với họ A.

Hình 5: Cấu trúc của KOD DNA polymerase [15]
1.4. Lựa chọn hệ thống biểu hiện
1.4.1. Vật chủ biểu hiện
Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu về KOD DNA polymerase lựa chọn
hệ thống biểu hiện ở E. coli [3, 12, 15, 23, 34], còn lại rất ít ở nấm men [37] và tế
bào côn trùng [40]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn hệ thống biểu hiện ở
E. coli BL21 với hai lý do chính. Thứ nhất, hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn như E.
coli là khá đơn giản và kinh tế vì cấu trúc thí nghiệm không phức tạp, thời gian nuôi
cấy ngắn và cung cấp được lượng protein tái tổ hợp lớn [7]. Thứ hai protein KOD
không yêu cầu quá trình biến đổi sau dịch mã.
Chủng vi khuẩn E. coli BL21 được tạo bởi F.William Studier và Barbara A.
Moffatt, là chủng vi khuẩn được lựa chọn phổ biến để sản xuất protein tái tổ hợp.
BL21(DE3) đã được cải biến mang gen T7 mã hóa cho T7 RNA polymerase dưới
sự kiểm soát của promoter lacUV5. T7 RNA polymerase giúp protein biểu hiện ở
mức độ cao dưới sự kiểm soát của T7 promoter [9].
12


Hình 6: Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống pET ở tế bào E. coli BL21 (DE3) [9]
Cơ chế biểu hiện gen ở tế bào E. coli BL21 dựa vào sự điều khiển của hai
promoter chính là promoter lac trên hệ gen vi khuẩn và T7 promoter ở vector biểu
hiện (Hình 6). Theo đó, khi ở trạng thái bình thường, Lac repressor sẽ bám vào lacO
và ngăn cản RNA polymerase bám vào promoter và do vậy quá trình phiên mã T7
gen1 không thể diễn ra. Tuy nhiên, khi có sự xuất hiện của chất cảm ứng IPTG, chất
này có khả năng ngăn lac repressor bám vào lacO, do vậy RNA polymerase có thể
bám vào lac promoter và quá trình phiên mã T7 gen1 được diễn ra. Khi đó T7 RNA
polymerase sẽ được tổng hợp, enzyme này giúp quá trình phiên mã gen đích trên
vector biểu hiện với sự điểu khiển của T7 promoter.
1.4.2. Vector
Vecto là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài các đoạn DNA cần
thiết, có khả năng tự sao chép, không phụ thuộc và sự phân chia của tế bào, tồn tại
độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ mà không gây biến đổi hệ gen của tế bào
vật chủ. Dựa vào mục đích sử dụng có thể chia vecto làm hai loại đó là vector nhân
dòng và vector biểu hiện.
Vectơ nhân dòng
Vector nhân dòng là DNA có thể gắn đoạn DNA đích vào và làm tăng số
lượng bản sao qua khả năng tự nhân đôi, không phụ thuộc vào hệ gen của vật chủ,

13


có thể nhận biết nhờ có các gen chỉ thị hoặc các gen đánh dấu. Vector nhân dòng có
thể là plasmid, bacteriophage hay nhiễm sắc thể nấm men (YAC). Loại vector nhân
dòng thường được chọn dựa trên kích thước của DNA đoạn chèn [26]. Plasmid là
các phân tử DNA nhỏ, mạch vòng có thể xâm lấn vào tế bào vi khuẩn và tự sao
chép được trong tế bào chủ. DNA plasmid có thể dược phân lập từ nuôi cấy vi
khuẩn chứa plasmid. Plasmid có chứa gen kháng kháng sinh để chọn lọc, vùng bắt
đầu sao chép cho phép plasmid có thể tự sao chép trong tế bào chủ. Plasmid là vectơ
có khả năng để chèn được DNA có kích thước nhỏ nhất, tối đa là 5 kb [26].
Vectơ biểu hiện
Vectơ biểu hiện là cấu trúc biểu hiện, được thiết kế để biểu hiện gen trong
các tế bào. Vectơ được dùng để đưa một gen cụ thể vào tế bào đích và có thể điều
khiển cơ chế của tế bào để tổng hợp được protein mã hóa bởi gen đó. Nó chứa các
trình tự điều hòa, trình tự tăng cường, promoter và các vùng cần thiết để biểu hiện
một gen mong muốn sử dụng cơ chế phiên mã và dịch mã của tế bào chủ. Vector
biểu hiện có thể là plasmid, phage, hay comid. Chúng đều có các vùng như vùng
sao chép, vùng gen chỉ thị, vị trí đa điểm cắt để chèn đoạn gen mong muốn và các
nhân tố khác cần thiết cho biểu hiện gen (ví dụ: promoter, vị trí bám ribosome, bộ
ba mở đầu, các đuôi để tinh sạch và các vị trí nhận biết cắt của protease....).
Hệ thống biểu hiện T7 ở pET vector
Mỗi hệ thống vector biểu hiện phù hợp với hệ thống vật chủ khác nhau.
Trong đó hệ thống pET vector là một hệ thống sử dụng T7 promoter, đây là một hệ
thống biểu hiện rất tốt ở E. coli. Gen đích được biểu hiện dưới sự điều hòa của T7
promoter, và sử dụng T7 RNA polymerase của tế bào vật chủ và được cảm ứng bởi
IPTG. Cấu trúc của hệ thống vector biểu hiện pET bao gồm các vùng sao chép,
vùng gen chỉ thị, vị trí đa điểm cắt, T7 promoter như cấu trúc của vector biểu hiện
pET-32a ở Hình 7. Vector pET-32a được thiết kế để nhân dòng và biểu hiện protein
ở mức độ cao khi trình tự peptide được dung hợp với protein thioredoxin TrxTagTM. Sau vị trí chèn gen là các vị trí của protein dung hợp His-Tag và S-Tag để
phát hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp. Trên vector cũng có trình tự nhận biết của
enzyme cắt protease thrombin giúp loại bỏ các protein dung hợp sau khi đã tinh
sạch được.

14


Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện pET-32a
Hệ thống biểu hiện ở pGEX vector
Đối với hệ thống biểu hiện ở pGEX vector của GE Healthcare, có nhiều các
gen dung hợp khác nhau, cùng được biểu hiện bởi tac promoter, với mức độ biểu
hiện cao với IPTG. Các vector pGEX đều có cấu trúc chung giống như các vector
biểu hiện khác, tuy nhiên, nó có dung hợp gen GST giúp protein đích được biểu
hiện tốt ở thể tan và có thể dễ dàng tinh sạch. Hình 8 mô tả cấu trúc của vector
pGEX-4T-1, vector này cũng gồm các vị trí như vùng sao chép, vùng chọn lọc, tac
promoter, vùng đa điểm cắt… Đặt biệt ở đầu N của protein tái tổ hợp sẽ được dung
hợp với đuôi GST giúp tinh sạch protein và vị trí nhận biết của protease thrombin
giúp cắt bỏ GST khỏi protein sau khi tinh sạch.

Hình 8: Cấu trúc vector biểu hiện pGEX-4T-1
15


1.5. Phƣơng pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực
Phương pháp sắc ký ái lực là phương pháp phân tách và tinh sạch một phân
tử đặc hiệu từ một nhóm các phân tử trong một hỗn hợp. Phương pháp này dựa trên
mối tương tác sinh học đặc hiệu giữa hai phân tử ví dụ như giữa kháng nguyên và
kháng thể, enzyme và cơ chất, hay chất cho và chất nhận. Những mối tương tác này
được ứng dụng để tinh sạch một trong các phân tử tương tác, được gọi là phối tử ái
lực (affinity ligand), trên một ma trận chất rắn ở pha tĩnh, còn các phân tử đích ở
pha động.
Có rất nhiều biến thể trong quy trình tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái
lực nhưng đều dựa trên ba bước cơ bản được mô tả cụ thể ở Hình 9. Đầu tiên, ủ mẫu
(tế bào đã được ly giải, serum) trong môi trường đệm thích hợp để mẫu có thể bám
vào phối tử ái lực trên cột (ligand). Sau đó, hỗn hợp được rửa bỏ các thành phần,
các chất không đặc hiệu bằng dung dịch đệm mà vẫn duy trì được ái lực của phân tử
đích và ligand. Cuối cùng, phân tử đích từ hỗn hợp với ligand được thu bằng dung
dịch đệm làm thay đổi ái lực của phân tử đích và ligand.

Hình 9: Các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực
Thông thường, các ligand được cố định và liên kết với các giá thể là chất
rắn, bằng cách hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm chức (ví dụ như:
cấu trúc bậc 1 của các nhóm amin, carboxylic axit, aldehyde…). Ví dụ như trường
16


hợp protein dung hợp với đuôi glutathione S-transferase (GST) sẽ dựa vào ái lực
giữa đuôi GST và chất khử glutathione. Hay là các protein dung hợp với như 6xHis,
polyHis – là những đuôi có ái lực với kim loại hóa trị II như nickel hay cobalt. Một
số đuôi dung hợp khác như HA, Myc, FLAG, SUMO hầu hết đều được gọi là đuôi
epitope vì chúng đòi hỏi phải có kháng thể đặc hiệu. Phương pháp sắc ký ái lực
được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vì hệ thống sử dụng khá là đơn
giản, và hiệu suất cao.
1.5.1. Sắc ký ái lực Nickel
Việc tinh sạch protein tái tổ hợp là điều kiện tiên quyết trong rất nhiều ứng
dụng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein. Protein tái tổ hợp được biểu
hiện với một loại protein dung hợp ở đầu N hoặc đầu C, giúp cho việc phát hiện và
tinh sạch được diễn ra dễ dàng. Một trong những protein dung hợp được sử dụng đó
là His-tag, nó gồm 6 – 9 histidine [38]. Vì kích thước rất nhỏ chỉ khoảng 0.84 kDa
cho nên đuôi này không làm thay đổi nhiều độ tích điện hay thường không làm ảnh
hưởng đến việc hình thành gấp xoắn, do đó không làm ảnh hưởng đến cấu trúc,
chức năng của protein [5]. Tuy nhiên đây cũng có thể là nhược điểm của phương
pháp này, vì có thế có những tương tác không đặc hiệu với các protein tổng số có
nhiều axit amin histidine.
Nguyên lý: Tinh sạch protein gắn đuôi His bằng phương pháp sắc ký ái lực
kim loại cố định (Immobilized metal affinity chromatography gọi tắt là IMAC) dựa
vào ái lực giữa nhóm axit amin Histidine và ion kim loại hóa trị II (Ni2+ hoặc Co2+)
như Hình 10. Những ion kim loại này được cố định trên ma trận sắc ký bằng
nitrilotriacetic acid (NTA) hoặc iminodiacetic acid (IDA) [4]. Điều kiện có thể thu
protein gắn đuôi His từ phương pháp IMAC dựa vào tính cạnh tranh của imidazole
với đuôi His.

17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×