Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu phân loại chi cóc (spondias l ) ở việt nam dựa trên hình thái và phân tử

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

ĐẶNG THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC
(SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH
THÁI VÀ PHÂN TỬ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Thực vật học

Hà Nội, tháng 05 năm 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

ĐẶNG THỊ ÁNH


NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC
(SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH
THÁI VÀ PHÂN TỬ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Thực vật học

Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Lê Chí Toàn

Hà Nội, tháng 05 năm 2019


LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan:
Khóa luận ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam
dựa trên hình thái và phân tử‖ là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi,
được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Chí Toàn. Các kết quả trình
bày trong khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công
trình nào trước đây.

Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019
Sinh viên

Đặng Thị Ánh

i


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt khoảng thời gian hoàn thành đề tài khóa luận này, tôi đã
nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ của thầy cô, người thân và bạn bè
xung quanh. Tôi rất cảm kích về điều đó.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý thầy cô, cán bộ của
khoa Sinh–KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, bằng cả tấm lòng, sự
nhiệt huyết, và những tri thức uyên bác của mình đã truyền đạt cho tôi những
kiến thức quý báu, những bài học kinh nghiệm mà phải mất khoảng thời gian
dài mới có thể đúc kết ra được.
Đặc biệt, với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành


nhất đến TS. Lê Chí Toàn – người thầy, người hướng dẫn trực tiếp đề tài khóa
luận này của tôi. Thầy đã đồng hành, trợ giúp tôi trong các bước đọc tài liệu,
chắt lọc, thu thập thông tin, làm thí nghiệm; cho tôi những kinh nghiệm hữu
ích trong quá trình nghiên cứu. Với kiến thức còn non nớt, và những kinh
nghiệm còn hạn chế thì việc thất bại trong quá trình nghiên cứu là lẽ tất yếu,
những lời khuyên của thầy đã giúp tôi nhận biết và khắc phục những sai sót
gặp phải, vượt qua giới hạn của bản thân để hoàn thành tốt đề tài khóa luận
này. Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, chúc thầy có thật nhiều sức
khỏe để có thêm nhiều đóng góp hơn trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học, và
chúc những dự án mà thầy đang ấp ủ thực hiện sẽ gặt hái được nhiều thành
công.
Ngoài ra chúng tôi xin trân thành cảm ơn trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này thông qua đề tài mã số
C.2019.01.
Thời gian tôi được làm quen, tiếp xúc với nghiên cứu khoa học chưa
nhiều, kiến thức và kinh nghiệm còn hạn hẹp nên không tránh được những
thiếu sót, tôi rất mong nhận được những lời góp ý của các quý thầy cô để bản
khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019
Sinh viên

Đặng Thị Ánh
ii


MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU ...................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài......................................................................................1
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu...........................................................2
3. Nội dung chính của đề tài ........................................................................3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................3
PHẦN NỘI DUNG ...............................................................................................4
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ..............................................................................4
1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ......................................4
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước..........................7
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam ........................................9
CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU .....................................................................................................................11
2.1. Đối tượng nghiên cứu .........................................................................11
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian ........................................11
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................13
2.3.1. Cách tiếp cận ....................................................................................13
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................13
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................20
3.1. Kết quả nghiên cứu thực địa ...............................................................20
3.2. Kết quả phân tích điện di và phân tích khối dữ liệu phân tử ..............20
3.3. Kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài..................................22
3.4 Các sửa đổi sắp xếp phân loại cho spondias l. Ở việt nam..................28
CHƢƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................32
4.1. Kết luận ...............................................................................................32
4.2. Kiến nghị .............................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................33

iii


PHỤ LỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các
trình tự DNA được giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể
hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới được giải trong nghiên
cứu này.
................................................................................................ 12
Bảng 2.2. Dụng cụ, máy móc sử dụng trong nghiên cứu................................. 15
Bảng 2.3. Hóa chất cần thiết được sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết
DNA, PCR, và điện di ............................................................................... 17
Bảng 2.4. Thông tin các mồi được sử dụng trong nghiên cứu ......................... 18

iv


PHỤ LỤC HÌNH
Hình 3.1. Kết quả điện di cho các trình tự của chi Cóc ................................... 20
Hình 3.2. Kết quả alignment. ........................................................................... 21
Hình 3.3. Cây phát sinh loài của chi Cóc (Spondias) theo phân tích Maximum
Likelihood từ dữ liệu kết hợp. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI
được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.22
Hình 3.4. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum
Likelihood từ dữ liệu gen matK. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI
được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.23
Hình 3.5. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum
Likelihood từ dữ liệu gen trnLF. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích
BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn
50%.
................................................................................................ 23
Hình 3.6. Hình thái lá, số lượng lá chét của Allospondias lakonensis (A) và
Spondias dulcis (B) .................................................................................... 24
Hình 3.7. Gân ở mép lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias
lakonenesis ................................................................................................ 25
Hình 3.8. Lông ở bề mặt lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias
lakonensis ................................................................................................ 25
Hình 3.9. Mẫu chuẩn của Spondias petteloti (A) và Allospondias laxiflora (B) .
.................................................................................................................. 26

v


PHỤ LỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ đầy đủ

Từ viết tắt
L.

Linnaeus

PCR

Polymerase Chain Reaction

PTN SHTT

Phòng thí nghiệm Sinh học trung tâm

sp.

Species

var.

Varietas

Viện NCKH & ƯD

Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

vi


PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Chi Cóc (Spondias L.) là một chi nhỏ thuộc họ Ðào lộn hột hay còn gọi là
họ Xoài (Anacardiaceae R. Br.) với khoảng 18 loài trên thế giới, chi Spondias
tập trung phân bố ở Nam Mỹ, châu Á và Madagascar [24]. Spondias là chi mẫu
chuẩn của phân họ Spondioideae Takht. emend. Pell & J. D. Mitch. và được ủng
hộ bằng dữ liệu phân tử qua nghiên cứu của Pell (2004), Mitchell và cộng sự
(2006), Pell và cộng sự (2011). Spondias là chi thực vật có giá trị kinh tế khá
cao. Quả, rễ của các loài Spondias có giá trị thương mại và y dược.
Lịch sử phân loại của chi Spondias khá phức tạp, đây là một trong những
chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus
(1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ Xoài
thành các nhóm và chia họ Xoài thành hai tông Anacardieae và Spondieae. Sau
đó, Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là
lần đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16].
Hai quan điểm phân loại của Spondioideae của Châu Á còn nhiều đối lập
trong sự phân chia các loài. Trong phiên bản sửa đổi chi Spondias nhiệt đới của
Châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với
một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc
điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn với lá kép lông chim, noãn đơn với noãn
đa, lá chét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6].
Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận
Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và
sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc
về chi Spondias. Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias
brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng
không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngoài ra,

1


Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó
khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19].
Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn
hay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các
nghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật. Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảm
bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu. Tuy nhiên
việc áp dụng công nghệ này vào các nghiên cứu trong nước còn ở mức hạn chế
cả về chất lượng và số lượng nghiên cứu. Đối với Spondias, kết quả từ dữ liệu
phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh,
trong đó Spondias Nam Mỹ là chi của Spondias châu Á [27].
Chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam được ghi nhận bao gồm 3 loài là S.
cytherea, S. petelotii, S. pinnata tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc
và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1].
Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài của
chi này được trồng rộng rãi. Tuy vậy việc nghiên cứu phân loại và mối quan hệ
phát sinh của các loài trong chi Spondias ở Việt Nam chưa được thực hiện. Do
đó, một nghiên cứu phân loại cho chi Spondias ở Việt Nam là cần thiết.
Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu phân loại
chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖.
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu
Tiến hành điều tra và khẳng định số lượng loài thuộc chi Spondias ở Việt
Nam.
Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và
xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt
Nam.
Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho
chi Spondias ở Việt Nam.
2


3. Nội dung chính của đề tài
Nghiên cứu tài liệu, tiêu bản của các loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam
tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Dược
liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên
– Đại học Quốc gia Hà Nội.
Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và
xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt
Nam.
Tiến hành các thí nghiệm như tách chiết DNA, PCR, giải trình tự một số
gen (03 gen lục lạp: rbcL, matK, trnLF) cho các mẫu của chi Spondias ở Việt
Nam.
Phân tích kết quả xử lí trình tự được nghiên cứu bằng chương trình và
thuật toán: Geneious, jModelTest, Maximum Likelihood, Bayesian Inference.
Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho
chi Spondias ở Việt Nam.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Đề tài góp phần tìm hiểu thực trạng số lượng các loài của chi Spondias ở
Việt Nam, từ đó đánh giá được mức độ đa dạng và đưa ra được các đề xuất nhằm
bảo tồn chi Spondias ở Việt Nam. Hơn nữa, đề tài sẽ đóng góp các thông tin, dữ
liệu cần thiết (cả hình thái, phân tử và sự phân bố) của chi Spondias ở Việt Nam
cho công tác xây dựng hệ thống Thực vật chí của Việt Nam. Ngoài ra, đề tài sẽ
giúp sinh viên được tìm hiểu và làm việc trực tiếp với các thí nghiệm và phân
tích phân tử hiện đại.

3


PHẦN NỘI DUNG
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu
Theo hệ thống phân loại APG III (2009), họ Xoài/Đào lộn hột
(Anacardiaceae) chứa khoảng 70 chi với khoảng 600 loài trên thế giới. Họ
Xoài được chia thành hai phân họ là phân họ Xoài với khoảng 10 chi và 115
loài và phân họ Đào lộn hột với khoảng 60 chi và 485 loài [8, 28].
Họ Xoài là họ thực vật có nhiều sản phẩm nông nghiệp nổi tiếng và có giá
trị kinh tế cao như là hạt điều, xoài, hạt tiêu hồng, và quả hồ trăn. Nhiều loài
trong các chi của họ Xoài được trồng và dùng làm thực phẩm như: Antrocaryon
(lấy quả và hạt), Bouea (quả), Buchanania (quả và hạt), Choerospondias (quả),
Rhus (quả), Cyrtocarpa (quả), Lannea (quả), Ozoroa (gỗ, quả), Fegimanra (hạt),
Haematostaphis (quả, hạt), Harpephyllum (quả), Pleiogynium (quả),
Pseudospondias (quả và hạt), Schinus L. (quả), Sclerocarya (quả), Searsia (quả),
Sorindeia (quả), Spondias (quả), và Trichoscypha (quả và hạt) [20].
Tuy không có thành viên của Anacardiaceae nào được xếp hạng là cây gỗ
lớn, nhưng giữ vai trò quan trọng trong thị trường gỗ nhỏ và được đánh giá cao
về chất lượng và khả năng chống mối mọt. Gỗ của Schinopsis ở Nam Mỹ có khả
năng chống mối mọt tốt và được sử dụng rộng rãi ở Argentina cho ngành đường
sắt. Các loại gỗ khác bao gồm: Abrahamia, Anacardium, Astronium,
Campnosperma, Ozoroa, Dracontomelon dao, Loxopterygium, Myracrodruon,
Protorhus, Schinopsis, Sclerocarya, Trichoscypha được sử dụng vào nhiều mục
đích khác nhau như trong sản xuất: làm diêm, tủ, cung, than, nhà ở, tay cầm rìu,
củi, bát, ván, và cột [20].
Nhiều loài của Anacardiaceae có giá trị việc trong trang trí sân vườn. Các
loài của Cotinus, Rhus, Schinus, Searsia, P. chinensis, P. mexicana,
Harpephyllum caffrum, Lannea coromandelica, Rhodosphaera, Smodingium, và
Toxicodendron được trồng thành cụm, có hoa đẹp để trang trí cho nhà cửa, tạo
4


hàng cây thường xanh hoặc rụng lá. Tuy nhiên, một vài loài sau khi được trồng
trong nông, lâm nghiệp hay trang trí đã phát triển vượt ra sự kiểm soát và trở
thành loài xâm lấn có thể kể tới như: Toxicodendron succedaneum ban đầu được
trồng ở Brazil, nhưng đã phát triển rất mạnh sau khi được giới thiệu trồng tại
Nhật Bản, hiện nay đang nằm trong danh sách loài xâm lấn ở Nhật Bản. Gần đây
Pistacia chinensishas được nhập trồng và bắt đầu xâm lấn ở Texas (Hoa Kỳ).
Ngoài ra, nhiều loài khác có giá trị cao trong y dược phẩm như: Spondias (quả:
lợi tiểu; rễ: làm kem dưỡng da; vỏ cây dùng sản xuất: thuốc tẩy, thuốc xổ, chữa
bệnh phong, chữa ho, trị các vết thương; lá: chữa bệnh phong, tẩy giun, trị đau
dạ dày) [20].
Chi Cóc thuộc phân họ Spondoideae. Chi này gồm 18 loài đã được mô tả,
trong số đó có 7 loài tìm thấy ở vùng nhiệt đới châu Á và 10 loài tìm thấy ở vùng
nhiệt đới Nam Mỹ, và 01 loài ở Madagascar. Trong số 18 loài Cóc được tìm
thấy, có 10 loài có lá và quả ăn được, các loài này được thuần hóa để trồng ở
vùng nhiệt đới châu Á và Nam Mỹ [28], trong đó, S. dulcis được trồng phổ biến
trên thế giới. S. dulcis ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ được dùng làm nước ép, làm
kem; ở vùng biển Caribbean nó được sử dụng như hương liệu tạo vị cho sữa
chua chứa nhiều vitamin C [20].
Trên thế giới, các nghiên cứu phân loại và phát sinh loài của thực vật hạt
kín được tiến hành từ rất sớm và đã có rất nhiều công bố khoa học được đăng
trên các tạp chí và sách chuyên ngành. Tuy nhiên việc sử dụng dữ liệu phân tử
vào các hướng nghiên cứu này ở Việt Nam còn rất hạn chế và tồn tại nhiều khó
khăn. Ngoài ra, số lượng và chất lượng các nghiên cứu phát sinh loài và tiến hóa
ở Việt Nam trong những năm gần đây là chưa cao.
Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn
hay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các
nghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật và di truyền. Kết quả từ dữ liệu phân tử
thường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên
cứu. Trong ba hệ gen gồm: gen nhân, gen ty thể và gen lục lạp; các trình tự của
5


gen lục lạp được sử dụng nhiều và phổ biến đối với các nghiên cứu thực vật.
Trình tự của ba gen rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase
large subunit), matK (Maturase K), trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial
sequence (trình tự từng phần); trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence;
và tRNA–Phe (trnF)) được sử dụng nhiều trong nghiên cứu hệ thống và phát
sinh của thực vật hạt kín nói chung và Spondias nói riêng [29].
rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), là
gen được tìm thấy trong lục lạp, quy định enzyme RuBisCO trong quá trình
quang hợp. rbcL có giá trị lớn và được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đánh giá
mối quan hệ phát sinh loài [29]. Tuy nhiên trình tự gen rbcL thường có tính bảo
thủ loài và chi khá cao, có nghĩa là trình tự rbcL của các loài trong cùng một chi
có độ tương đồng cao. Mặc dù vậy, rbcL là gen dễ khuếch đại và tạo thuận lợi
cho nhiều nghiên cứu.
matK (Maturase K) là một gen lục lạp, protein của nó mã hóa một
maturase intron [29]. Trình tự gen matK thường có tính bảo thủ loài thấp do đó
rất hữu ích cho nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên, matK lại là một trong những
trình tự gen lục lạp khó khuếch đại nhất. Mặc dù vậy, matK vẫn là một gen được
sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu hiện nay. Để khắc phục khó khăn trong
quá trình khuếch đại (PCR) các nhà khoa học có thể tác động đến chương trình
chạy PCR hoặc thay đổi trình tự mồi. Yu và cộng sự (2011) đề xuất việc sử dụng
matK và thúc đẩy việc áp dụng matK như một mã vạch DNA bằng việc sử dụng
các loại mồi mới. Nghiên cứu sử dụng 58 loài từ 47 họ thực vật hạt kín, kết quả
của nghiên cứu này chỉ ra rằng các đoạn mồi mới có khả năng khuếch đại mạnh
mã gen matK (93,1%) và tỷ lệ trình tự có thể sử dụng được là rất cao (92,6%)
[14, 23].
trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence; trnL–trnF intergenic
spacer, complete sequence; and tRNA–Phe (trnF) gene) cũng là một gen lục lạp,
tuy nhiên trnLF là một gen khảm, phân mảnh, nó bao gồm ba đoạn là trnL,
trnL–trnF intergenic spacer và trnF. Trình tự của gen trnLF có tính bảo thủ thấp,
6


do đó cung cấp nhiều thông tin cho việc xác định rõ ràng mối quan hệ của các
loài nên có giá trị sử dụng cao trong nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên đây cũng là
một gen khó khuếch đại và đặc biệt là rất khó gióng hàng và căn trình tự [29].
Hệ thực vật của Việt Nam rất đa dạng và chưa được nghiên cứu kĩ, đặc
biệt là các nghiên cứu phát sinh loài sử dụng dữ liệu phân tử. Do đó, đây là một
hướng nghiên cứu có thể đóng góp nhiều thông tin và dữ liệu quý giá cho khoa
học thế giới và Việt Nam.
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc trên thế giới
Lịch sử phân loại của chi Cóc Spondias khá là phức tạp, đây là một trong
những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus
(1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ này thành
các nhóm và chia họ này thành hai tông Anacardieae và Spondieae [9]. Sau đó,
Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần
đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16].
Hai quan điểm phân loại của Spondioideae châu Á còn nhiều đối lập trong
sự phân chia các loài. Trong phiên bản sửa đổi của Spondias nhiệt đới của châu
Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một
khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm
nhận biết đặc trưng như: lá đơn vs. lá kép lông chim, noãn đơn vs. noãn đa, lá
chét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6].
Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận
Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và
sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc
về chi Spondias [19]. Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias
brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng
không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngoài ra,

7


Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó
khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19].
Kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae
được chia thành hai nhánh, trong đó Spondias Nam Mỹ nằm ở một nhánh phát
sinh riêng biết và có quan hệ chị em gần gũi với Spondias châu Á, điều này cũng
gợi ý cho nghiên cứu lịch sử tiến hóa và phát sinh của chi Spondias trên toàn thế
giới.
Chayamarit (1997) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột
ở Thái Lan dựa trên dữ liệu phân tử (bao gồm chi Spondias), tuy nhiên do sự hạn
chế về việc lấy mẫu và các trình tự gen (chỉ bao gồm duy nhất một gen rbcL)
nên kết quả của nghiên cứu này là rất hạn chế đối với chi Spondias. Kết quả chỉ
ra rằng, Spondias có quan hệ gần gũi và nằm trên cùng một nhánh phát sinh với
Dracontomelon [10].
Pell (2004) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột dựa trên
dữ liệu sinh học phân tử và hình thái (bao gồm chi Spondias). Nghiên cứu được
tiến hành trên 9 chi của họ Ðào lộn hột bao gồm cả Spondias, sử dụng trình tự
của 5 gen: ETS, ITS, trnLF, rps16, matK. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, khi kết
hợp 2 gen ETS và ITS cho chỉ số ủng hộ bootstrap cao hơn khi kết hợp 3 gen
ETS, ITS và trnLF [20].
Trong thực vật chí Trung Quốc, Min and Barfod (2008) ghi nhận hai loài
của chi Spondias ở Trung Quốc là S. pinnata và S. lakonensis. Loài S. lakonensis
bao gồm hai thứ là S. lakonensis var. lakonensis và S. lakonensis var. hirsuta
[18].
Silva và cộng sự (2015) thực hiện nghiên cứu phát sinh các loài của chi
Spondias ở Nam Mỹ dựa trên dữ liệu phân tử. Nghiên cứu được tiến hành trên 6
loài của chi Spondias ở Nam Mỹ sử dụng trình tự của 3 gen là rbcL, matK và
trnH–psbA spacer [24]. Kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, trình tự gen rbcL và
matK của các loài thuộc Spondias ở Nam Mỹ là tương đối bảo thủ, trong khi đó,
8


trnH–psbA spacer khá là khác biệt giữa các loài và có thể cho phép phân biệt
được các loài.
Al–Saghir (2017) tiến hành nghiên cứu bản đồ nhiễm sắc thể của 5 loài
thuộc chi Spondias sử dụng kính hiển vi huỳnh quang [7]. Kết quả của nghiên
cứu thể hiện rằng, tất cả 5 loài được nghiên cứu đều có chung bộ nhiễm sắc thể
là 2n = 32. Hơn nữa, tất cả các loài Spondias có quan hệ di truyền gần gũi.
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam
Chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam đến nay được ghi nhận bao gồm 3 loài là
S. cytherea, S. petelotii, S. pinnata và tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía
bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai)
[1]. Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài
của chi này được trồng rộng rãi.
Tuy nhiên, theo Phạm Hoàng Hộ (2003) chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam
bao gồm 3 loài là S. cythera, S. pinnata và S. mombin. Tuy vậy, tác giả cũng
nhấn mạnh rằng ông chỉ quan sát thấy S. cythera, S. pinnata (dọc ven biển từ
Vinh tới Đà Lạt, Đồng Nai), trong khi S. mombin có lẽ là không chắc chắn [2].
Lê Thị Kim Phụng và Trần Thị Tướng An (2013) tiến hành nghiên cứu
chiết xuất pectin từ vỏ Cóc (S. cytherea) bằng phương pháp hỗ trợ bởi vi sóng
[3]. Nghiên cứu đưa ra một quy trình tối ưu cho việc chiết xuất pectin từ vỏ cóc
sử dụng các tác nhân hóa học (HCl và cồn 96o) kết hợp với vi sóng (MAE –
microwave assisted extraction method) ở 400 W trong 10 phút. Quy trình này
được cho là giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu quả sản xuất pectin so với
phương pháp chiết xuất truyền thống.
Nguyễn Xuân Quyền và cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu giá trị sử
dụng của các loài trong họ Xoài ở Việt Nam. Nghiên cứu đã chỉ ra các giá trị sử
dụng khác nhau của các loài trong họ Xoài, trong đó có giá trị của các loài Cóc
(Spondias L.) là: cây ăn quả, làm thuốc, lấy gỗ, làm cảnh [4].

9


Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân loại và hệ thống phát sinh của Spondias
chưa được quan tâm chú trọng vì vậy mối quan hệ phát sinh của các loài thuộc
chi Spondias ở Việt Nam là chưa rõ ràng. Do đó, một nghiên cứu phân loại và
phát sinh cho Spondias ở Việt Nam là cần thiết.
Sử dụng phương pháp phân loại dựa trên dữ liệu hình thái và phân tử
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias
L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖.

10


CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành trên các đối tượng loài thuộc chi Cóc như đã được
ghi nhận trong ―Danh lục các loài thực vật Việt Nam‖ và một số tài liệu có liên
quan. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng tiến hành thu thập và phân tích thông tin,
dữ liệu phân tử một số loài Cóc trên thế giới dựa trên dữ liệu từ Ngân hàng Gen
(Genbank–NCBI).
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 14 loài (16 cá thể) của hai chi
Spondias và Allospondias (Bảng 2.1). Trong đó bao gồm: 04 mẫu được thu ở
Việt Nam, 12 mẫu được thu thập trên ngân hành Gen thế giới (Genbank –
NCBI).
Nghiên cứu sử dụng 03 loài thuộc chi Buchanania (B. siamensis, B.
reticulata và B. glabra) làm đối chứng cho phân tích phát sinh loài.
Nghiên cứu sử dụng 03 gen lục lạp bao gồm rbcL, matK và trnLF cho các
phân tích phát sinh loài. Phương pháp tách chiết, PCR, giải trình tự và phân tích
được trình bày chi tiết ở mục 3.
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian
2.2.1. Phạm vi nghiên cứu
Phân tích hình thái và phân tử sử dụng các mẫu tươi, các tiêu bản khô, các
trình tự DNA của các loài thuộc chi Cóc ở Việt Nam.
2.2.2. Địa điểm
Một số địa điểm được ghi nhận phân bố của các loài thuộc chi Spondias
tại Việt Nam.
Địa điểm kiểm tra tiêu bản khô: Phòng tiêu bản, Viện Sinh thái và Tài
nguyên Sinh vật; Viện Dược liệu; Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam; Bảo tàng
Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
11


Bảng 2.1. Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA đƣợc giải mới
hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới đƣợc giải
trong nghiên cứu này.
Loài
Spondias tuberosa Arruda
Spondias mombin L.
Spondias venulosa (Engl.) Engl.
Spondias purpurea L.
Spondias sp.

Địa điểm
Brazil
USA; Costa Rica
Brazil
Mexico
Brazil
Brazil

Spondias radlkoferi Donn.Sm.
Spondias testudinis J.D. Mitch. & D.C.
Daly
Spondias malayana Kosterm.
Spondias globosa J.D. Mitch. & D.C. Daly
Spondias bahiensis P.Carvalho, Van den
Berg & M.Machado
Spondias acida Blume
Spondias dulcis Parkinson
Spondias pinnata (Koenig ex L.f.) Kurz
Allospondias laxiflora Lace
Allospondias laxiflora Lace
Allospondias laxiflora Lace
Buchanania glabra Wall. ex Engl.

Ngƣời thu mẫu
W. Thomas s.n. (NY)
Mitchell s.n. (NY); Roberto E. 528
F. Arreola & F. Mora s.n.

M. C. Machado & N. G. Antas 1563

USA
Brazil

Pell 775 (BKL)
C. van den Berg 2171
E. Melo, M. C. Machado & B. M. Silva
11933
D.A. Powell & H'ng Kim Chey 579
M. C. Machado, A. R. Barbosa & M. R.
Santos 1302; Weiblen, G. D. WS5B0380
C.T. Le Le10
C.T. Le Le04
C.T. Le Le18
C.T. Le Le17
Pell 1062 (NY)
Pell 1054 (NY); Toyama et al. 554
(KYUM)
Pell 1057 (NY); Toyama et al. 167
(KYUM)

Australia
Brazil
Lai Chau, Vietnam
Lang Son, Vietnam
Vinh Phuc, Vietnam
Vietnam
Vietnam

Buchanania siamensis Miq.

Vietnam

Buchanania reticulata Hance

Vietnam; Cambodia

rbcL
KP774626
JQ590140
KP774632
KP774619
KP774630

trnLF
KP055577
KP055575
KR081921
KR081868


GQ981883

KR081870









KR081875
KP055574
KR081819







KR081811
KR081767

KP774606
XXX
XXX
XXX



JF739148
XXX
XXX
XXX



KR081815
XXX
XXX
XXX
XXX
KP055491

AB925072

AB925701

KP055493

AB924829

AB925441

KP055492

R. Perez s.n.; E. Mart nez S., C. H.
Ramos, R. Lombera & G. Dom nguez
25557


Brazil

Brazil

matK
KP774614
KP774609
KP774610
KP774612
KP774613

12


Địa điểm thu mẫu: một số tỉnh của Việt Nam như Vĩnh Phúc, Phú Thọ,
Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Tp. Hồ Chí Minh.
Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Thực vật, Viện Nghiên
cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học sư phạm Hà Nội 2.
2.2.3. Thời gian: 10/2018–05/2019.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Cách tiếp cận
Nghiên cứu tiêu bản của các loài Spondias tại phòng tiêu bản Viện Sinh
thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Dược liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,
Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiến hành nghiên cứu thực địa và thu mẫu trong điều kiện cho phép.
Tiến hành thí nghiệm tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Phương pháp thu thập tài liệu và nghiên cứu tiêu bản
Thu thập, tổng hợp các tài liệu liên quan đến chi Spondias và các chi có
quan hệ gần gũi với Spondias.
Nghiên cứu tiêu bản của các loài Spondias: kiểm tra đặc điểm hình thái,
thu thập các thông tin cần thiết trên tiêu bản (tên khoa học, tên địa phương, địa
điểm thu mẫu, người thu và các ghi chú trên tiêu bản).
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu thực địa và thu mẫu
Tiến hành thực địa từ một đến hai lần tại những địa điểm được ghi nhận có
sự phân bố của chi Spondias, nhằm thu mẫu tiêu bản (một hoặc hai tiêu bản với
mỗi mẫu thu được) và mẫu để tách chiết DNA.

13


Mẫu tiêu bản sau khi được xử lý cắt tỉa sẽ được ép phẳng và sấy khô để
bảo quản cho nghiên cứu lâu dài. Trong khi đó, đối với mẫu DNA, các mẫu lá sẽ
được lấy và chứa trong các túi kẹp có chứa hạt hút ẩm để làm khô mẫu và tránh
phá hủy cấu trúc DNA, các mẫu DNA này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm
phân tử.
2.3.2.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái
Nghiên cứu sử dụng phương pháp hình thái so sánh dựa trên các đặc điểm
cấu tạo bên ngoài của các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của thực vật, trong đó
đặc biệt là cơ quan sinh sản [5]. Nhiều tiêu bản chi Cóc được nghiên cứu (nghiên
cứu online thông qua các hình ảnh của tiêu bản được công bố) ở nhiều phòng
tiêu bản và bảo tàng trên thế giới như: HN, HNU, PE, HAL, TCD, L, C, A và
KUN. Các kí hiệu tên của phòng tiêu bản theo the Index Herbariorum
(http://sweetgum.nybg.org/ih/). Ngoài ra, chúng tôi cũng nghiên cứu tiêu bản ở
phòng tiêu bản bộ môn Thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 (*) và phòng
tiêu bản của Viện Dược liệu (**).
Khóa định loại được xây dựng theo kiểu khóa lưỡng phân.
2.3.2.4. Phương pháp tách chiết DNA, PCR, giải trình tự gen
Các mẫu DNA được đánh kí hiệu tương đồng với mẫu tiêu bản và tiến
hành tách DNA theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide)
[12].
Các dụng cụ, máy móc, và hóa chất cần thiết cho các thí nghiệm tách chiết
DNA, PCR, và điện di được trình bày trong Bảng 2.2 và 2.3.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
Để tiến hành các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR và điện di cần chuẩn bị:
Các loại đầu tip, bi sắt nghiền mẫu, ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) cần
được hấp vô trùng và để khô.

14


Bảng 2.2. Dụng cụ, máy móc sử dụng trong nghiên cứu
Số TT

Tên dụng cụ máy móc

Đơn vị quản lý

1.

Ống eppendorf

Nhóm nghiên cứu

2.

Đầu típ các loại

Nhóm nghiên cứu

3.

Bi nghiền mẫu

Nhóm nghiên cứu

4.

Kẹp, giấy lau, giấy parafilm, gang Nhóm nghiên cứu
tay, khẩu trang

5.

Đèn cồn

PTN Thực vật

6.

Máy sấy mẫu

PTN Thực vật

7.

Tủ lạnh

PTN Thực vật

8.

Tủ lạnh âm sâu

PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD

9.

Bộ micropipet đơn kênh

PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD

10.

Máy nghiền mẫu Tissuelyser II

Viện NCKH & ƯD

11.

Cân phân tích

Viện NCKH & ƯD

12.

Máy li tâm

Viện NCKH & ƯD

13.

Nồi hấp (bể ổn nhiệt)

Viện NCKH & ƯD

14.

Máy PCR

Viện NCKH & ƯD

15.

Bộ điện di

Viện NCKH & ƯD

16.

Hệ thống chụp ảnh gel điện di

Viện NCKH & ƯD

17.

Lò vi sóng

Viện NCKH & ƯD

Các ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) được dùng trong thí nghiệm cần được
đánh số mã hóa và ghi thông tin đầy đủ như: thời gian, tên mẫu…
15


Các mồi cần được pha loãng bằng ddH2O (nước cất 2 lần và khử ion) trước khi
sử dụng.
Phƣơng pháp tách chiết DNA
Bước 1. Lấy mẫu. Dùng gang tay, kẹp để lấy 2 gram mẫu khô vào ống
eppendorf 2.0 đã được hấp vô trùng, đánh số mã hóa và chuẩn bị bi sắt.
Bước 2. Nghiền mẫu. Sử dụng máy Tissuelyser II, thời gian nghiền là 80
giây chia 4 lần.
Bước 3. Cho 800µl đệm CTAB (CTAB buffer) vào mỗi ống, lắc ống từ 510 phút để mẫu trộn đều trong hóa chất.
Bước 4. Đem mẫu hấp ở nhiệt độ 65oC trong vòng 1 giờ 30 phút trong bể
ổn nhiệt.
Bước 5. Cho 700µl CI (24:1) vào từng mẫu ống, lắc đều 10 phút.
Bước 6. Ly tâm mẫu ở tốc độ 13000 vòng/15 phút, sử dụng máy ly tâm
Mikro 200R.
Bước 7. Hút và chuyển lớp dung dịch ở phía trên cùng thu được sau ly tâm
sang ống eppendorf 1,5 mới đã chuẩn bị sẵn (đã được đánh số mã hóa).
Bước 8. Cho 800µl isopropanol vào ống eppendorf 1,5 mới chuyển dung
dịch sang, lắc đều trong vòng 5-10 phút, sẽ thu được kết tủa DNA.
Bước 9. Đem ủ các ống mẫu sau lắc ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút.
Bước 10. Lấy mẫu sau ủ và tiến hành ly tâm 13000 vòng/15 phút, lọc dịch,
thu kết tủa DNA.
Bước 11. Rửa kết tủa DNA bằng cồn 70%, tiến hành 2-3 lần. Sau đó để
khô 30 phút trong tủ hút.
Bước 12. Thêm 100µl dịch đệm TE (TE buffer) vào mỗi ống mẫu chứa
DNA lắc đều và bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (-20 đến -50 oC).

16


Bảng 2.3. Hóa chất cần thiết đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết
DNA, PCR, và điện di
Số TT Tên hóa chất

Thí nghiệm sử dụng

1.

CTAB buffer

Tách chiết DNA

2.

CI (chloroform–isoamyl alcohol, 24:1)

Tách chiết DNA

3.

Isopropanol

Tách chiết DNA

4.

Cồn 70o

Tách chiết DNA

5.

TE buffer

Tách chiết DNA

6.

MasterMix

PCR

7.

ddH2O

PCR

8.

Primers (mồi các loại, gồm xuôi và ngược)

PCR

9.

Marker (HighRanger 1Kb DNA ladder)

Điện di

10.

Agarose G10

Điện di

11.

TAE 50X

Điện di

12.

Thuốc nhuộm DNA

Điện di

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng PCR:
Tiến hành chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) sau khi tách các mẫu
DNA. Phản ứng PCR sử dụng 2×Taq PCR MasterMix (Biomed, China) bao gồm
0,05 u/μL of Taq DNA Polymerase, 4 mM MgCl2, 0,4 mM of dNTPs và buffer
của phản ứng.
Hỗn hợp phản ứng PCR chứa 25 µl cho mỗi phản ứng (mỗi ống mẫu) bao
gồm:
 12,5 µl MasterMix.
17


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×