Tải bản đầy đủ

Nghiên cứu quá trình nhân giống xoan ta (melia azedarach l ) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro và ex vitro từ vật liệu khác nhau

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
==  ==

NGUYỄN THỊ KIM ANH

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG
XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO
VÀ EX VITRO TỪ VẬT LIỆU KHÁC NHAU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền – Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
==  ==

NGUYỄN THỊ KIM ANH


NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG
XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO
VÀ EX VITRO TỪ VẬT LIỆU KHÁC NHAU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền – Công nghệ sinh học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

TS. PHAN THỊ THU HIỀN
TS. NGUYỄN VĂN PHONG

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Thị Thu Hiền giảng
viên Khoa Sinh - KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 và TS. Nguyễn
Văn Phong cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp trƣờng Đại học
Lâm Nghiệp đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban
Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Các thầy cô cán bộ
Viện Nghiên Cứu Khoa học và ứng dụng trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2,
Các anh chị cán bộ nhân viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo
mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận
tình của T.S Nguyễn Xuân Thành - Viện trƣởng Viện Nghiên Cứu Khoa học
và ứng dụng trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Th.S Ong Xuân Phong cùng
toàn thể các thầy cô cán bộ Viện Nghiên Cứu Khoa học và ứng dụng trƣờng
Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề
tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm sinh
lí thực vật, Phòng thí nghiệm Di truyền học - trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo
điều kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa
luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019


Sinh viên

NGUYỄN THỊ KIM ANH


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các
số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai
công bố.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

NGUYỄN THỊ KIM ANH


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP

: 6-Benzyl amoni purin

Cs

: Cộng sự

IBA

: Indol -3- butyric acid

Kinetin

: 6-fufuryl amino purin

MS

: Murashige và Skoog

mg/l, g/l

: Miligam/lít, gam/lít

NAA

: Napthlacetic acid

Nxb

: Nhà xuất bản

µM

: Micromol


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng khi dùng javen 5% đến khả
năng tạo mẫu sạch………………………………………………
14
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tạo mô
sẹo từ vật liệu lá mầm……………………………………………... 16
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tạo mô
sẹo từ vật liệu thân mầm xoan ta………………………………….. 17
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh
chồi…………………………………………………………............ 19
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng IBA đến khả năng tạo rễ
từ mô sẹo………………………………………………………… 21
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của các loại giá thể đến khả năng sống của cây Xoan
ta……………………………………………………………............ 21
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của tuổi chồi lấy hom đến khả năng ra rễ của hom
Xoan ta…………………………………………………………….. 23
Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến kết quả giâm hom Xoan ta…….. 24
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến kết quả giâm hom Xoan ta…… 25
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của loại giá thể đến kết quả giâm hom Xoan ta……

27


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Rừng Xoan ta ................................................................................... 3
Hình 1.2: Cành, hoa, quả Xoan ta ..................................................................... 3
Hình 3.1: Mẫu sạch đƣợc tạo từ hạt Xoan ta .................................................. 15
Hình 3.2: Mô sẹo đƣợc hình thành sau 3 tuần nuôi cấy.................................. 18
Hình 3.3: Chồi tái sinh từ mô sẹo sau 3-4 tuần nuôi cấy ................................ 20
Hình 3.4: Tạo rễ và huấn luyện đƣa cây mô ra bầu đất .................................. 22
Hình 3.5: Chồi lấy hom 30 ngày tuổi .............................................................. 23
Hình 3.6: Giâm Xoan ta trên giá thể 100% cát sông ...................................... 27
Hình 3.7: Xoan ta đƣợc giâm hom ở nồng độ IBA 12,5 mg/l ........................ 26


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích của nghiên cứu .............................................................................. 1
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 1
3.1. Nghiên cứu quá trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo bằng phƣơng pháp
nuôi cấy in vitro ........................................................................................ 1
3.2. Nghiên cứu quá trình nhân giống ex vitro băng phƣơng pháp giâm hom
Xoan ta ...................................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu ........................................... 3
1.1.1. Giới thiệu về giống Xoan ta .................................................................... 3
1.1.2. Cơ sở của việc nhân giống in vitro Xoan ta ............................................ 4
1.1.3. Nuôi cấy mô tế bào ................................................................................. 5
1.2. Những công trình nghiên cứu về những giống cây Xoan ta đƣợc tiến
hành bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô ....................................................... 6
1.2.1. Các công trình nghiên cứu nhân giống Xoan ta trên thế giới ................. 6
1.2.2. Các công trình nghiên cứu nhân giống Xoan ta ở Việt Nam .................. 7
1.2.3. Các công trình nghiên cứu về nhân giống ex vitro ................................. 7
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 8
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................. 8
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian................................................ 8


2.2.1 Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 8
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 8
2.2.3 Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 8
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 8
2.3.1 Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 8
2.3.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 9
3.1. Nghiên cứu quá trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo bằng phƣơng pháp
nuôi cấy in vitro ...................................................................................... 14
3.1.1 Tạo mẫu sạch giống Xoan ta .................................................................. 14
3.1.2. Tạo mô sẹo từ vật liệu Xoan ta ............................................................. 16
3.1.3. Tái sinh chồi từ vật liệu mô sẹo Xoan ta............................................... 19
3.1.4. Tạo rễ và huấn luyện đƣa cây mô ra bầu đất ........................................ 21
3.2. Nghiên cứu quá trình nhân giống ex vitro bằng phƣơng pháp giâm hom
Xoan ta .................................................................................................... 22
3.2.1. Ảnh hƣởng của tuổi chồi lấy hom đến khả năng ra rễ Xoan ta ............ 22
3.2.2. Ảnh hƣởng của loại và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến kết
quả giâm hom Xoan ta ............................................................................ 24
3.2.3. Ảnh hƣởng của loại giá thể đến kết quả giâm hom Xoan ta ................. 26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận ....................................................................................................... 28
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 30


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Xoan ta (Melia azedarach L.) là cây thân gỗ, sớm rụng lá, thuộc họ xoan
(Meliaceae), có nguồn gốc ở Ấn Độ, miền Nam Trung Quốc và Australia [4].
Xoan ta đƣợc phân bố ở nhiều nƣớc nhƣ Việt Nam, Lào, Campuchia [4].
Riêng ở Việt Nam từ Bắc vào Nam hầu nhƣ tỉnh nào cũng canh tác cây Xoan
ta, chúng đƣợc trồng thành rừng để lấy gỗ, che bóng, phòng hộ [4]. Xoan ta là
một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp,
đƣợc trồng ở 6 trong 9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó có các vùng :
Vùng Đồng bằng sông Hồng, vùng Trung du, vùng Tây Bắc, vùng Nam
Trung bộ, vùng Tây Nguyên, vùng Đông Nam bộ [4]. Hiện nay cây Xoan ta
đang đƣợc khuyến khích trồng và ngày càng đƣợc mở rộng diện tích [4]. Xuất
phát từ nhu cầu sản xuất thực tiễn chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
quá trình nhân giống Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng phƣơng pháp
nuôi cấy in vitro và ex vitro từ vật liệu khác nhau”
2. Mục đích của nghiên cứu
Nghiên cứu quá trình nhân giống cây Xoan ta từ mô sẹo bằng phƣơng
pháp nuôi cấy in vitro, ex vitro từ nguyên liệu thực vật khác nhau.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu quá trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro
Khả năng tạo mẫu sạch Xoan ta
Khả năng tạo phôi soma từ vật liệu Xoan ta
Khả năng tái sinh chồi từ vật liệu phôi soma Xoan ta
Khả năng tạo rễ và huấn luyện đƣa cây mô ra bầu đất
- Các thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Bùi Văn Thắng
và cs [5] có cải biến để chọn ra môi trƣờng tái sinh chồi thích hợp nhất.

1


3.2. Nghiên cứu quá trình nhân giống ex vitro băng phương pháp giâm
hom Xoan ta
Ảnh hƣởng của tuổi chồi lấy hom đến khả năng ra rễ Xoan ta
Ảnh hƣởng của loại và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến kết quả
giâm hom Xoan ta
Ảnh hƣởng của loại giá thể đến kết quả giâm hom Xoan ta
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Đoàn Thị Mai và
cs [8] có cải biến để chọn ra công thức thích hợp nhất.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: Bổ sung vào nguồn tƣ liệu khoa học cho nghiên
cứu kỹ thuật nuôi cấy mô Xoan ta và kĩ thuật nhân giống vô tính cây
Xoan ta bằng phƣơng pháp giâm cành.
Ý nghĩa thực tiễn: Đƣa ra cơ sở phục vụ cho nhu cầu nhân nhanh số
lƣợng cây Xoan ta. Góp phần sản xuất cây giống có năng suất cao, chất
lƣợng tốt, góp phần cung cấp cho các đơn vị trồng rừng nhằm phát triển
rừng nguyên liệu có năng suất cao.

2


NỘI DUNG
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Giới thiệu về giống Xoan ta
Xoan ta có tên khoa học là Melia azedarach L., đây là loài cây lâm
nghiệp có giá trị cao, đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới và đƣợc
trồng thành rừng hoặc phân tán ở hầu khắp các tỉnh từ Bắc đến Nam [3].

Hình 1.1: Rừng Xoan ta (Nguồn: Lê Mộng Chân-2000 [3])
Về hình thái giải phẫu : Xoan ta có chiều cao cây có thể đạt tới 30 m,
đƣờng kính 100 cm [3]. Thân khá thẳng, tán thƣa, vỏ màu xám nâu, nứt hoặc
rạn dọc [3]. Lá kép lông chim 2 đến 3 lần, mọc cách [3]. Lá chét mép có răng
cƣa [3]. Hoa đều, lƣỡng tính, màu tím nhạt, hợp thành cụm, có mùi thơm hắc,
bầu nhụy có 5 đến 6 ô, quả hạch dài 1-2 cm [3].

Hình 1.2: Cành, hoa, quả Xoan ta (Nguồn: Lê Mộng Chân-2000 [3])
Xoan ta là cây gỗ lớn, có nhiều tác dụng : Trồng rừng để lấy gỗ lớn hay
trồng để che bóng hay phòng hộ, gỗ nhẹ, có thân thớ đẹp, khá bền và khó bị
mối mọt nên đƣợc dùng trong xây dựng, trang trí nội thất và điêu khắc, lá
Xoan đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc trừ sâu tự nhiên để bảo quản lƣơng
thực, làm phân xanh và thuốc sát trùng, hạt ép lấy dầu, than củi Xoan ta cho

3


nhiệt lƣợng cao [3]. Cây Xoan ta có mặt ở hầu hết các vùng sinh thái lâm
nghiệp trên khắp Việt Nam [3]. Vì vậy việc ứng dụng công nghệ sinh học để
cải thiện chất lƣợng giống Xoan ta là rất cần thiết, có ý nghĩa quan trọng đối
với kinh tế lâm nghiệp cũng nhƣ môi trƣờng sinh thái [3].
1.1.2. Cơ sở của việc nhân giống in vitro Xoan ta
1.1.2.1. Kĩ thuật nhân giống in vitro
1.1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Cơ sở nền tảng của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là học thuyết về tính
toàn năng của tế bào do nhà thực vật học ngƣời Đức Haberland đƣa ra vào
năm 1902 [2]. Kế thừa quan điểm của ông, các nhà sinh học hiện đại cho rằng
tất cả các tế bào cấu tạo nên cơ thể thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di
truyền đủ để mã hóa hình thành một cơ thể [2]. Các nhà nghiên cứu cho rằng
mỗi tế bào thực vật khi tách ra khỏi cơ thể nếu đƣợc nuôi trong điều kiện
thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [2]. Từ đó đến nay,
rất nhiều các công trình nghiên cứu đã tạo ra đƣợc cây hoàn chỉnh từ một tế
bào riêng lẻ, một khối mô hay từ một phần của cơ quan [2]. Điều đó khẳng
định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô, tế
bào thực vật [2].
1.1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật in
vitro thực chất là kết quả phân hóa và phản phân hóa tế bào [2].
Quá trình phân hóa tế bào bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn phân bào,
giai đoạn giãn và giai đoạn phân hóa [2]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các
tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng
khác nhau của cơ thể [2].
Sự phản phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là các tế
bào đã phân hóa chức năng sẽ bị phản biệt hóa tạo thành các tế bào mô sẹo
[2]. Sau đó, các tế bào mô sẹo tái sinh tạo thành chồi hay phôi soma và từ đó
tái tạo thành cây hoàn chỉnh [2].

4


1.1.2.2. Kĩ thuật nhân giống ex vitro
Xoan có nhiều tiềm năng phát triển rộng khắp các tỉnh [4]. Khi diện
tích trồng Xoan tăng đồng nghĩa với việc tăng nguồn giống [4]. Để khắc phục
những nhƣợc điểm nhân giống bằng hạt ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp
nhân giống ex vitro [8]. Xoan giâm hom giúp nhân nhanh, góp phần tiết kiệm
thời gian, chi phí, công sức đồng thời góp phần tạo ra lƣợng lớn giống cây
trồng cung cấp cho các đơn vị trồng rừng nhằm phát triển rừng nguyên liệu
có năng suất cao, phẩm chất gỗ tốt [8].
1.1.3. Nuôi cấy mô tế bào
1.1.3.1. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến nuôi cấy mô tế
bào
Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng gồm cả vi lƣợng và đa
lƣợng đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy [2]. Nhu cầu về muối khoáng của tế
bào và mô thực vật tách rời là không khác nhiều so với yêu cầu của cây đƣợc
trồng trong điều kiện tự nhiên [2]. Trong nuôi cấy mô tế bào, môi trƣờng
nuôi cấy và môi trƣờng xung quanh là 2 vấn đề chính quyết định đến sự
thành bại của quá trình nuôi cấy [2]. Môi trƣờng nuôi cấy là nguồn cung
cấp các chất cần thiết cho sự tăng trƣởng và phân hóa mô trong suốt quá
trình nuôi cấy [2]. Cơ sở của việc xây dựng các môi trƣờng nuôi cấy là
việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của
cây [2]. Tùy từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tùy cơ quan
khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh dƣỡng cần cho sự sinh trƣởng tối ƣu
của chúng là khác nhau [2]. Trong môi trƣờng nuôi cấy số lƣợng và các
loại hóa chất phải cực kỳ chính xác với từng đối tƣợng cụ thể [2].
1.1.3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến nuôi cấy mô tế
bào
Các chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò quan trọng trong kĩ thuật nuôi
cấy mô thực vật [2]. Bằng cách cung cấp các chất điều hòa sinh trƣởng ở một
mức thích hợp ngƣời nghiên cứu có thể điều khiển đƣợc chiều hƣớng phát
sinh hình thái của mẫu nuôi cấy [2]. Auxin và cytokinin là 2 chất đƣợc sử
dụng phổ biến nhất [2]. Ngoài ra ngƣời ta còn sử dụng gibberellin [2]. Hiệu

5


quả tác động của chất điều hòa sinh trƣởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng,
hoạt tính vốn có của chúng và mẫu nuôi cấy [2]. Auxin có hiệu quả kích thích
sự sinh trƣởng của tế bào, cùng với cytokinin làm tăng phân bào, hạn chế ƣu
thế đỉnh, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phôi vô tính
[2].
1.1.3.3 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
Các mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc đặt trong phòng nuôi ổn định về ánh
sáng và nhiệt độ [2]. Tất cả các tế bào mô nuôi cấy đều cần ánh sáng trừ một
số trƣờng hợp nuôi cấy tạo mô sẹo [2]. Điều kiện nuôi cấy phải phù hợp với
từng giai đoạn phát triển của quá trình nuôi cấy in vitro và ex vitro [2].
1.1.3.4 Ảnh hưởng của pH
Độ pH của môi trƣờng là yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng
hòa tan các chất khoáng trong môi trƣờng, sự ổn định của môi trƣờng, khả
năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của cây [2]. Vì vậy đối với mỗi loại môi
trƣờng nhất định và đối với từng trƣờng hợp cụ thể của các loài cây phải
chỉnh độ pH của môi trƣờng về mức độ ổn định ban đầu [2]. Nếu pH thấp
(pH < 4,5) hoặc cao (pH > 7,0) đều gây ức chế sinh trƣởng, phát triển của
cây trong nuôi cấy in vitro [2]. Đối với mô sẹo của nhiều loại cây, pH ban
đầu thƣờng là 5,5-6,0 và sau 4 tuần nuôi cấy đạt đƣợc 6,0-6,5 [2]. Đặc
biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính axit cao nhƣ axit
amin, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH để làm tăng hoặc dùng HCl
loãng để làm giảm pH môi trƣờng về 5,5-6,5 [2].
1.2. Những công trình nghiên cứu về những giống cây Xoan ta đƣợc
tiến hành bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô
1.2.1. Các công trình nghiên cứu nhân giống Xoan ta trên thế giới
Nghiên cứu về cây xoan đƣợc tiến hành theo hai hƣớng chủ yếu là
xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen [14]. Năm 2000, Shekhawat đã
nhân nhanh thành công cây Xoan từ hạt in vitro và đạt 90% tỷ lệ tái sinh
trên môi trƣờng MS [18]. Ngoài ra, Ahmad và Thakar cũng đã tái sinh
thành công chồi đỉnh từ cây trƣởng thành. Vila tái sinh gián tiếp bằng cách
sử dụng thâm mầm và lá mầm làm vật liệu ban đầu [17]. Năm 2009,
6


Husain và cs đã nghiên cứu nhân giống cây Xoan ta hiệu quả, môi trƣờng
tạo đa chồi cao nhất là MS có bổ sung 5 µM BAP và 0,5 µM NAA với tỉ lệ
sống và tạo đa chồi là 92% [14]. Một số công trình nghiên cứu chuyển gen
vào cây Xoan ta thông qua Agrobacterium tumefaciens đạt hiệu quả
chuyển gen cao [15,16].
1.2.2. Các công trình nghiên cứu nhân giống Xoan ta ở Việt Nam
Nghiên cứu trên cây Xoan ta đƣợc triển khai rộng rãi ở Việt Nam ở
nhiều hƣớng nghiên cứu khác nhau nhƣ nuôi cấy mô, chuyển gen, nhân giống
in vitro [3]. Một số công trình tập trung nghiên cứu quy trình tái sinh tốt từ
mô sẹo nhƣ công trình Đỗ Xuân Đồng và cs [5]. Một số công trình khác
nghiên cứu hệ thống tái sinh cây Xoan ta thông qua phôi soma từ thân mầm
phục vụ chuyển gen [5,10]. Ngoài ra, còn có 1 số công trình khác nghiên cứu
chuyển các gen có tính kháng với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng hoặc
tạo năng suất cao [13].

1.2.3. Các công trình nghiên cứu về nhân giống ex vitro
Ở nƣớc ta, kĩ thuật nhân giống trong điều kiện ex vitro đã đƣợc nghiên
cứu và ứng dụng rộng rãi với nhiều loại cây trồng lâm nghiệp [3]. Đứng trƣớc
giá trị của cây Xoan ta cùng với nhu cầu về gỗ thì vấn đề nghiên cứu mở rộng
nhân giống, gây trồng loài Xoan ta là rất cấp thiết, các nghiên cứu về chọn
giống và nhân giống sinh dƣỡng cây Xoan ta đã bƣớc đầu đƣợc thực hiện tại
Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng [3]. Sau đó đƣợc thực hiện rộng rãi ở
các trung tâm, Viện nghiên cứu khắp cả nƣớc [3]. Đoàn Thị Mai và cs, nghiên
cứu quy trình nhân giống Xoan ta bằng phƣơng pháp giâm hom và ghép cành
[8]. Một số công trình nghiên cứu tiêu biểu khác về nhân giống ex vitro nhƣ :
Trần Hữu Biển nghiên cứu nhân giống vô tính bằng hom loài Giáng hƣơng
[1], Đỗ Ngọc Quỹ nghiên cứu về kĩ thuật nhân giống ex vitro chè [12]. Đoàn
Thị Mai nghiên cứu chuyển giao kĩ thuật nhân giống sinh dƣỡng ex vitro cho
cây rừng [7]. Nguyễn Hoàng Nghĩa, nhân giống vô tính và trồng rừng các
dòng vô tính cây lâm nghiệp [9].

7


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Cây Xoan ta
- Vật liệu nghiên cứu :
Hạt Xoan ta này do Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại
học Lâm nghiệp cung cấp. Sau đó loại bỏ phần thịt quả bằng cơ giới và tách
lấy hạt làm vật liệu nuôi cấy. Gieo hạt tạo cây con trong ống nghiệm theo
phƣơng pháp của Hồ Văn Giảng và cs [6], sử dụng thân mầm và lá mầm tạo
mô sẹo làm vật liệu tái sinh chồi tạo cây con hoàn chỉnh [6].
Các chồi thu từ cây Xoan ta đã qua xử lí tạo chồi đƣợc Viện Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp cung cấp sử dụng để
nuôi cấy ex vitro.
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian
2.2.1 Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở phòng thí nghiệm.
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà
Nội 2, Viện Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Lâm nghiêp.
2.2.3 Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ tháng 7/2017 đến tháng 5/2019.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức đƣợc
nhắc lại 3 lần, 90 mẫu/công thức đối với quá trình nuôi cấy mô in vitro và 30
mẫu/công thức đối với quá trình ex vitro. Số liệu đƣợc xử lí trên phần mềm
Microsof Excel 2013.

8


Khử trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy ở nhiệt độ 1210C, áp suất
1,5 atm trong 15 phút. Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 20-250C cƣờng độ
ánh sáng 3000 lux với thời gian chiếu sáng 16h/ngày.
2.3.2 Nội dung nghiên cứu
2.3.2.1 Nghiên cứu quá trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro
-Tạo mẫu sạch cây Xoan ta
Hạt đƣợc sấy 50-60oC trong thời gian vừa đủ khô nƣớc→ hạt (phôi) giữ
đƣợc nƣớc, không chết phôi hạt.
Đập hạt, tách phôi.
Khử trùng sơ bộ bằng xà phòng 2-3 lần (5 phút) để loại bỏ tạp chất, vi
sinh vật lạ.
Khử trùng bằng cồn 90o trong 4-5 phút.
Tẩy tiếp bằng javen 30-50 phút, chia làm 2 lần khử trùng.
Rửa sạch bằng nƣớc cất.
Hạt ra giấy thấm, thấm khô hạt.
Cấy hạt trong môi trƣờng vào mẫu (MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga,
pH = 5,8) 5-7 phôi/bình.
+ Công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng:
ĐC
Xử lí sơ bộ
CT1
Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/30 phút trong 1 lần
CT2
Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/30 phút trong 2 lần
CT3
Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/40 phút trong 1 lần
CT4
Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/40 phút trong 2 lần
CT5
Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/50 phút trong 1 lần
CT6
Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/50 phút trong 2 lần
-Thí nghiệm đƣợc tiến hành dựa theo công thức của Hồ Văn Giảng và
cs [6].
-Tạo mô sẹo từ vật liệu Xoan ta

9


+ Xoan ta sau khi đƣợc nảy mầm trong ống nghiệm 7-10 ngày đƣợc cắt
thành các đoạn thân dài 0,5 cm bỏ các chồi nách, lá, ngọn và các đoạn lá cắt
thành mảnh nhỏ có kích thƣớc 1,5 cm x1,5 cm, sau đó đƣợc nuôi cấy trên môi
trƣờng: MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga có bổ sung thêm BAP và NAA, pH
= 5,8. Điều kiện nuôi cấy tối trong 1 tuần, sau đó chuyển sang nuôi sáng,
cƣờng độ ánh sáng 2000-3000 lux, nhiệt độ phòng nuôi cấy 25±20C, số giờ
chiếu sáng 10h/ngày.
-Công thức thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của sự phối kết hợp các
chất điều hòa sinh trƣởng tới khả năng tạo mô sẹo.
+Vật liệu từ lá mầm Xoan ta:
ĐC
CT1
CT2
CT3
CT4

MS
MS + 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA
MS + 1 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA
MS + 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l NAA
MS + 0,5 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA

+ Vật liệu từ thân mầm cây Xoan ta:
ĐC
CT1
CT2
CT3
CT4

MS
MS + 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA
MS + 1 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA
MS + 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l NAA
MS + 0,5 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA

-Thí nghiệm đƣợc tiến hành dựa theo công thức của Nguyễn Văn Phong
và cs [11].
-Tái sinh chồi từ vật liệu mô sẹo Xoan ta
+ Những mô sẹo đã lục hóa đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh
chồi: MS + BAP mg/l + NAA mg/l; MS + BAP mg/l + kinetin mg/l; MS +
BAP mg/l + kinetin mg/l + NAA mg/l, pH = 5,8. Nuôi cấy trong điều kiện:

10


cƣờng độ chiếu sáng 2000-3000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25±2oC, số giờ
chiếu sáng 10h/ngày.
+ Công thức tái sinh chồi từ vật liệu mô sẹo Xoan ta:
ĐC
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5
CT6

MS
MS + 0,2 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA
MS + 0,2 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin
MS + 0,2 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin
MS + 0,3 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin
MS + 0,3 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin
MS + 0,3 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA
-Thí nghiệm đƣợc tiến hành dựa theo công thức của Nguyễn Văn Phong

[11].
-Tạo rễ và huấn luyện đƣa cây mô ra bầu đất
+ Kế thừa và phát triển những kết quả tác giả Nguyễn Văn Phong [11].
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng công thức cho ra rễ với thành phần:
MS + 30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga, pH = 5,8, có bổ sung thêm IBA ở các nồng
độ khác nhau. Tiếp sau đó cây đƣợc trồng trên giá thể đất và đất mùn với tỉ lệ
khác nhau.
-Công thức tạo rễ cây Xoan ta:
ĐC
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5

MS
MS + 0,3 mg/l IBA
MS + 0,4 mg/l IBA
MS + 0,5 mg/l IBA
MS + 0,6 mg/l IBA
MS + 0,7 mg/l IBA

- Công thức bầu đất huấn luyện cây mô:
ĐC
CT1
CT2
CT3

100% đất
75% đất + 25% đất mùn
50% đất + 50% đất mùn
25% đất + 75% đất mùn

11


2.3.2.2. Nghiên cứu quá trình nhân giống ex vitro bằng phương pháp
giâm hom Xoan ta
- Ảnh hƣởng của tuổi chồi lấy hom đến khả năng ra rễ Xoan ta
+ Thí nghiệm tiến hành trên các chồi lấy hom có độ tuổi khác nhau: 10,
20, 30, 40, 50 ngày tuổi đƣợc xử lí cùng nồng độ IBA 12,5 mg/l, giâm hom
trên loại giá thể chứa 100% cát sông.
+ Theo dõi và ghi lại kết quả sau 2-3 tuần giâm hom
+ Công thức thí nghiệm:
ĐC
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5

0
10 ngày tuổi
20 ngày tuổi
30 ngày tuổi
40 ngày tuổi
50 ngày tuổi

+ Thí nghiệm đƣợc tiến hành dựa theo công thức của Đoàn Thị Mai và
cs [8].
- Ảnh hƣởng của loại và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến kết quả
giâm hom Xoan ta.
+ Sử dụng 2 loại chất điều hòa sinh trƣởng là NAA và IBA với nồng độ
thay đổi từ 5-15 mg/l, số mẫu giâm hom cho mỗi lần là 20 mẫu, thí nghiệm
tiến hành 3 lần lặp lại. Giâm trong giá thể chứa 100% cát sông, mật độ giâm
hom 5 cm x 5 cm. Duy trì độ ẩm tối ƣu và cƣờng độ ánh sáng yếu trong suốt
thời gian giâm hom, theo dõi và ghi lại kết quả sau 20 ngày giâm hom.
+ Công thức thí nghiệm với các nồng độ IBA khác nhau:
ĐC

0

CT1

5 mg/l

CT2

7,5 mg/l

CT3

10 mg/l

CT4

12,5 mg/l

CT5

15 mg/l
12


-Công thức thí nghiệm với các nồng độ NAA khác nhau:
ĐC

0

CT1

5 mg/l

CT2

7,5 mg/l

CT3

10 mg/l

CT4
CT5

12,5 mg/l
15 mg/l

+Thí nghiệm đƣợc tiến hành dựa theo công thức của Đoàn Thị Mai và cs [8].
-Ảnh hƣởng của loại giá thể đến kết quả giâm hom Xoan ta
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 5 loại giá thể khác nhau: (1) 100% đất
tầng màu, (2) 70% đất + 30% chấu, (3) 50% đất tầng màu + 30% chấu + 20%
cát, (4) 50% đất tầng màu + 50% cát sông, (5) 100% cát sông.
Hom sử dụng trong thí nghiệm là hom Xoan ta 30 ngày tuổi và loại
chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng là IBA với nồng độ 12,5 mg/l.
-Sau 30 ngày tiến hành điều tra và thu thấp kết quả
-Các loại giá thể thí nghiệm đều đƣợc xử lí nấm bệnh và tƣới phun ẩm
trong môi trƣờng nhƣ nhau.
-Công thức thí nghiệm:
ĐC
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5

0
100% đất tầng màu
70% đất + 30% trấu
50% đất tầng màu + 30% trấu + 20% cát
50% đất tầng màu + 50% cát sông
100% cát sông

+Thí nghiệm đƣợc tiến hành dựa theo công thức của Đoàn Thị Mai và
cs [8].

13


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu quá trình nhân giống Xoan ta từ mô sẹo bằng phƣơng
pháp nuôi cấy in vitro
3.1.1 Tạo mẫu sạch giống Xoan ta
Trong nuôi cấy mô thực vật, quá trình vào mẫu nuôi cấy mô là một
bƣớc làm khó, trong đó phƣơng pháp khử trùng mẫu là yếu tố rất quan trọng.
Do vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tạo mẫu sạch và thu đƣợc kết quả
ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng khi dùng javen 5% đến
khả năng tạo mẫu sạch
Hóa
chất

Thời
Thời
gian khử gian
trùng
khử
lần 1
(phút)
(phút)

30
Javen
5%
40

50

Thời
Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu
gian khử chết (%)
nhiễm (%)
sạch
nảy
lần
2
mầm (%)
TB (%)±SD TB (%)±SD
(phút)
TB (%)±SD

30

0

30,00 ± 0,42

50,00 ± 0,57

20,00 ± 0,25

15

15

20,00 ± 0,22

36,67 ± 0,23

43,33 ± 0,44

40

0

16,67 ± 0,17

33,33 ± 0,33

50,00 ± 0,24

20

20

3,33 ± 0,34

10,00 ± 0,18

86,67 ± 0,33

50

0

46,67 ± 0,09

10,00 ± 0,21

43,33 ± 0,17

25

25

23,33 ± 0,54

26,67 ± 0,45

50,00 ± 0,25

14


Kết quả thu đƣợc từ bảng 3.1 cho thấy : Dùng chất khử trùng Javen 5%
với thời gian từ 30-50 phút thì số mẫu bị chết tăng, tƣơng ứng từ 20-46,67%,
số mẫu bị nhiễm giảm từ 50-10%. Khi chia thời gian khử làm 2 lần với tổng
thời gian không đổi thì lƣợng mẫu chết khác nhau, cụ thể ở thời gian 40 phút :
16,67% và 3,33%. Trong các công thức nghiên cứu này thì khử trùng Javen
5% ở thời gian 40 phút (2 lần) cho tỉ lệ tái sinh tốt nhất lên tới 86,67% sau 5-7
ngày, mẫu sạch nảy mầm thành các cây sạch khỏe, sinh trƣởng, phát triển
(Hình 3.1) tốt hơn so với khử trùng vào mẫu bằng các công thức khác. Ở công
thức này tỉ lệ mẫu nhiễm và chết tƣơng đối thấp tƣơng ứng 10% và 3,33%.
Từ kết quả nghiên cứu này đã chọn Javen 5% làm chất khử trùng với
thời gian 40 phút chia làm 2 lần (20 + 20) để tạo mẫu sạch từ hạt Xoan ta
(Hình 3.1).

A

B

C

Hình 3.1: Mẫu sạch đƣợc tạo từ hạt Xoan ta
A: Hạt Xoan sau 5 ngày; B: Xoan ta sau 10 ngày; C: Xoan sau 14 ngày

15


3.1.2. Tạo mô sẹo từ vật liệu Xoan ta
Mô sẹo là những khối tế bào chƣa phân hóa chức năng. Những thân và
rễ bất định thƣờng đƣợc phân hóa từ mô sẹo. Chất lƣợng mô sẹo ảnh hƣởng
trực tiếp tới khả năng tái sinh và sức sống của cây non sau này. Việc nghiên
cứu kĩ các yếu tố tác động tới mô sẹo và tìm ra hàm lƣợng chính xác cũng nhƣ
loại vật liệu ban đầu cho chất lƣợng mô sẹo tốt nhất là điều kiện cần thiết.
Kế thừa những kết quả nghiên cứu trƣớc của tác giả Hồ Văn Giảng và
cs [6] khẳng định khi bổ sung vào môi trƣờng hỗn hợp 2 chất NAA và BAP,
tùy vào tỉ lệ thích hợp sẽ tạo ra mô sẹo với số lƣợng và chất lƣợng khác nhau.
Trong nghiên cứu này, sử dụng môi trƣờng tạo mô sẹo bao gồm MS +
30 g/l sucroza + 6,8 g/l aga, pH = 5,8 và bổ sung phối kết hợp các chất BAP
và NAA theo hàm lƣợng nhƣ trong bảng 3.2.
Vật liệu từ lá mầm Xoan ta
Lá của cây Xoan ta đƣợc cắt thành mảnh nhỏ có kích thƣớc 1,5 cm x
1,5 cm và đƣợc cấy lên môi trƣờng tạo mô sẹo. Kết quả nghiên cứu đƣợc theo
dõi và ghi lại trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tạo mô
sẹo từ vật liệu lá mầm
Thí nghiệm

BAP

NAA

(mg/l)

(mg/l)

Tỉ lệ tạo mô sẹo
(%)

Đặc điểm mô sẹo

TB (%)±SD
ĐC

0

0

00,00 ± 0,00

CT1

1,0

1,0

43,33 ± 0,25

Trắng, xanh, cứng

CT2

1,0

1,5

93,33 ± 0.31

Trắng, xanh, cứng

CT3

0,5

1

86,67 ± 0,33

Trắng, xanh, xốp

CT4

0,5

1,5

26,67 ± 0.46

Trắng, vàng, xốp

16


Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×