Tải bản đầy đủ

Phát triển nguồn vật liệu mang gen kháng vi khuẩn bạc lá (Xanthomonas Oryzae PV. Oryzae) phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cho các tỉnh phía bắc Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI


VÕ THỊ MINH TUYỂN



PHÁT TRIỂN NGUỒN VẬT LIỆU MANG GEN KHÁNG
VI KHUẨN BẠC LÁ (XANTHOMONAS ORYZAE PV. ORYZAE)
PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHO CÁC
TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM



Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62620501


LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP




Người hướng dẫn: TS. Phạm Ngọc Lương
PGS.TS. Vũ Văn Liết




HÀ NỘI, 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là
trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận án này ñã
ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án ñều ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả



Võ Thị Minh Tuyển

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS Vũ Văn Liết - Phó hiệu
trưởng trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện trưởng Viện Nghiên cứu Lúa và
TS Phạm Ngọc Lương - Trưởng bộ môn ðột biến và Ưu thế lai - Viện Di truyền
Nông nghiệp là những người thầy ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện
thuận lợi và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt 5 năm liền thực hiện và
hoàn thành luận án này.
Tôi xin cám ơn chân thành ñến ThS. Nguyễn Thị Minh Nguyệt ñã hết lòng
giúp ñỡ tôi những kiến thức trong lĩnh vực sinh học phân tử và những tài liệu tham
khảo chuyên môn quý giá.
Trong thời gian qua, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ quý báu của Ban lãnh ñạo


Viện Di truyền Nông nghiệp, các cán bộ, các bạn bè ñồng nghiệp trong bộ môn ðột
biến & Ưu thế lai và bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp. Nhân
dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ quý báu ñó.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Viện ðào tạo Sau ñại học, Khoa Nông học
và Bộ môn Di truyền và Chọn giống cây trồng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà
Nội ñã tạo ñiều kiện giúp tôi hoàn thành tốt các mục tiêu nghiên cứu và mọi thủ tục
ñể có thể hoàn thành luận án này.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia ñình tôi ñã luôn bên tôi, quan tâm
và tạo ñiều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ quý báu của các tập thể và
cá nhân ñã dành cho tôi.

Tác giả



Võ Thị Minh Tuyển
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
iii

MỤC LỤC


Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình ix
MỞ ðẦU 1
1 Tính cấp thiết của ñề tài 1
2 Mục tiêu của ñề tài 2
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2
4 Những ñóng góp mới của luận án 3
5 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu 3
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và trong nước 4
1.1.1 Sản xuất lúa trên thế giới 4
1.1.2 Sản xuất lúa ở Việt Nam 5
1.2 Bệnh bạc lá lúa 6
1.2.1 Những nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa 6
1.2.2 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa 8
1.2.3 Các gen kháng bệnh bạc lá lúa 12
1.3 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng 16
1.3.1 Chỉ thị phân tử 16
1.3.2 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa 20
1.4 Nuôi cấy bao phấn và ứng dụng trong chọn tạo giống lúa 30
1.4.1 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn 30
1.4.2 Ứng dụng nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống lúa 32
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
iv

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1 Vật liệu nghiên cứu 38
2.2 Nội dung nghiên cứu 39
2.2.1 ðánh giá nguồn vật liệu khởi ñầu và xác ñịnh các chỉ thị phân tử
liên kết gen kháng bệnh bạc 39
2.2.2 Xác ñịnh các cá thể lai mang gen kháng bệnh bạc lá ñưa vào nuôi
cấy bao phấn lúa tạo dòng ñơn bội kép. 39
2.2.3 ðánh giá các dòng ñơn bội kép thu ñược, xác ñịnh tập ñoàn vật liệu
mang gen kháng bệnh bạc lá: xa5, Xa7, Xa21 và chọn lọc các dòng
lúa triển vọng 39
2.2.4 Xác ñịnh dòng triển vọng kháng bệnh bạc lá lúa phục vụ cho sản xuất 40
2.3 Phương pháp nghiên cứu 40
2.3.1 Thí nghiệm ñánh giá ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng giống lúa 40
2.3.2 Phương pháp chỉ thị phân tử 41
2.3.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo 42
2.3.4 Phương pháp lai 44
2.3.5 Nuôi cấy bao phấn con lai ñã ñược chuyển gen 45
2.3.6 ðánh giá dòng ñơn bội kép. 47
2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 47
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 48
3.1 ðánh giá nguồn vật liệu khởi ñầu và xác ñịnh các chỉ thị phân tử liên
kết gen kháng bệnh bạc lá 48
3.1.1 ðánh giá và xác ñịnh vật liệu cho gen kháng sử dụng trong thí nghiệm 48
3.1.2 ðánh giá, chọn lọc và xác ñịnh nguồn vật liệu nhận gen sử dụng
trong nghiên cứu. 49
3.1.3 Xác ñịnh các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen kháng vi
khuẩn bạc lá xa5, Xa7, Xa21 ñể sử dụng trong chọn giống lúa
kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử 52
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
v

3.2 Chọn lọc con lai bằng chỉ thị phân tử, xác ñịnh các cá thể lai mang gen
kháng vi khuẩn bạc lá ñưa vào nuôi cấy bao phấn lúa tạo dòng ñơn bội kép 56
3.2.1 Chọn lọc các cá thể lai mang gen kháng xa5, Xa7 - Sơ ñồ lai 1 56
3.2.2 Chọn lọc các cá thể lai ở các thế hệ BC
1
F
1
, BC
2
F
1
, BC
3
F
1
(của tổ
hợp lai MT508-1 và dòng IRBB62) mang gen kháng Xa7, Xa21 –
Sơ ñồ lai 2 59
3.2.3 Nuôi cấy bao phấn các cá thể lai mang gen kháng bệnh bạc lá tạo
dòng ñơn bội kép 69
3.3 ðánh giá các dòng ñơn bội kép thu ñược, xác ñịnh tập ñoàn vật liệu
mang gen kháng bệnh bạc lá lúa: xa5, Xa7, Xa21 và chọn lọc các dòng
lúa triển vọng 74
3.3.1 ðánh giá các dòng ñơn bội kép thu ñược từ nuôi cấy bao phấn các
cá thể lai mang gen kháng vi khuẩn bạc lá xa5, Xa7 74
3.3.2 Kiểm tra, ñánh giá các dòng ñơn bội kép mang gen kháng vi
khuẩn bạc lá Xa7, Xa21 thu ñược từ tổ hợp lai MT508-1/IRBB62 82
3.3.3 Thảo luận, ñánh giá kết quả chọn tạo dòng vật liệu và dòng lúa
triển vọng theo 2 sơ ñồ lai tạo 92
3.4 ðánh giá các dòng triển vọng mang gen kháng bệnh bạc lá 97
3.4.1 ðánh giá ñặc ñiểm nông - sinh học chính của các dòng triển vọng 97
3.4.2 ðánh giá tính chống chịu và khả năng kháng với một số sâu bệnh
hại chính của các dòng triển vọng 99
3.4.3 ðánh giá giống lúa triển vọng DT45 và DT47 ở các vùng sinh thái
khác nhau 101
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 105
1 Kết luận 105
2 ðề nghị 105
Danh mục các công trình ñã công bố có liên quan ñến luận án 106
Tài liệu tham khảo 107
Phụ lục 122
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chữ viết ñầy ñủ
ADN Axit dezoxyribonucleic
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
BC Lai trở lại (Backcross)
bp Base pair (cặp nucleotide)
CAPs Cleaved Amplification Polymorphisms
cM Centimorgan (ñơn vị chiều dài bản ñồ di truyền)
CTPT Chỉ thị phân tử
DH Dòng ñơn bội kép (Double haploid )
DTV Dòng triển vọng
DVL Dòng vật liệu
FAO Tổ chức Nông lương của liên hợp quốc
IGC Uỷ ban Ngũ cốc quốc tế
IRRI Viện nghiên cứu lúa quốc tế (International rice research institute)
Is Isolate (chủng vi khuẩn)
MAS chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (-Assisted Selection)
MS Murashige & Skoog
NILs Những dòng tương ñồng gen (Nearly isogenic lines)
NST Nhiễm sắc thể
Nu Nucleotit
N6 Chu's N6
PCR Polymerase Chain Reaction
RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNAs
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SNPs Single nucleotide polymorphism
SSR Những trình tự lặp lại ñơn giản (Simple Sequence Repeats)
STS Sequence Tagged Site
TGMS Bất dục ñực chức năng di truyền nhân phản ứng với nhiệt ñộ
Xoo Vi khuẩn gây bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
vii

DANH MỤC BẢNG


STT Tên hình Trang

2.1 Các dòng mang gen kháng của Viện nghiên cứu Lúa quốc tế IRRI 38
3.1 ðặc ñiểm nông - sinh học chính của các dòng vật liệu (Vụ xuân - 2006) 50
3.2 ðánh giá các dòng vật liệu bằng lây nhiễm nhân tạo 51
3.3 Trình tự mồi cho ña hình sử dụng trong thí nghiệm 55
3.4 Phản ứng của các cá thể lai F5/7 mang gen kháng với các chủng bạc
lá (Vụ xuân – 2008) 58
3.5 Kết quả lai tạo theo sơ ñồ lai 1 59
3.6 Kết quả ñánh giá kiểu hình kháng, nhiễm của các dòng BC
1
F
1
(Vụ
mùa – 2008) 61
3.7 ðánh giá ñặc ñiểm nông - sinh học chính của các cá thể lai BC
1
F
1

mang 2 gen kháng (Vụ mùa 2008) 62
3.8 Kết quả ñánh giá kiểu hình kháng, nhiễm của các cá thể lai BC2F1 mang
gen kháng bệnh bạc lá (tổ hợp lai MT x IRBB62) - Vụ xuân 2009 64
3.9 ðánh giá ñặc ñiểm nông - sinh học chính của các cá thể lai BC
2
F
1
(tổ
hợp lai MT x IRBB62) mang 2 gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa7, Xa21
(Vụ xuân 2009) 65
3.10 Kết quả ñánh giá kiểu hình kháng, nhiễm của các dòng BC
3
F
1
(tổ hợp
lai MT x IRBB62) - Vụ mùa 2009 67
3.11 Kết quả chọn các cá thể lai mang gen kháng bệnh bạc lá theo sơ ñồ lai 2 68
3.12 Kết quả nuôi cấy bao phấn các cá thể lai mang gen kháng vi khuẩn
bạc lá 69
3.13 Số liệu về cây xanh tái sinh thu ñược 73
3.14 Phản ứng của các dòng ñơn bội kép (MT5 và MT7) mang gen kháng
bệnh với các chủng bạc lá - vụ mùa 2007 76
3.15 Phản ứng của các dòng ñơn bội kép (MT5/7) mang gen kháng với các
chủng bạc lá khác nhau - Vụ mùa 2008 79
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
viii

3.16 Một số ñặc ñiểm nông - sinh học chính của các dòng ñơn bội kép
mang gen kháng – Sơ ñồ lai 1 (vụ mùa 2008) 80
3.17 Kết quả chọn tạo nguồn vật liệu mang gen kháng (Sơ ñồ lai 1) 82
3.18 Phản ứng của các dòng ñơn bội kép (MT1) mang gen kháng với các
chủng bạc lá khác nhau - Vụ xuân 2009 84
3.19 Một số ñặc ñiểm nông - sinh học chính của các dòng ñơn bội kép
(MT1) - Vụ xuân 2009 85
3.20 Phản ứng của các dòng ñơn bội kép MT2 mang gen kháng với các
chủng bạc lá khác nhau - Vụ mùa 2009 87
3.21 Một số ñặc ñiểm nông - sinh học chính của các dòng ñơn bội kép MT2
- Vụ mùa 2009 88
3.22 Phản ứng của các dòng ñơn bội kép MT3 mang gen kháng với các
chủng bạc lá khác nhau - Vụ xuân 2010 90
3.23 Một số ñặc ñiểm nông - sinh học chính của các dòng ñơn bội kép
(MT3) - Vụ xuân 2010 91
3.24 Kết quả chọn tạo dòng vật liệu mang gen kháng bệnh bạc lá theo sơ ñồ 2 92
3.25 Kết quả chọn tạo dòng vật liệu mang gen kháng bệnh bạc lá 93
3.26 Kết quả chọn tạo dòng triển vọng kháng bệnh bạc lá 95
3.27 Kết quả chọn tạo dòng vật liệu và dòng triển vọng mang 2 gen kháng
bệnh bạc lá 97
3.28 ðặc ñiểm nông - sinh học chính của các dòng triển vọng ở vụ mùa 98
3.29 ðánh giá khả năng chống chịu của các dòng triển vọng trên ñồng ruộng
- Vụ mùa 2010 100
3.30 Kết quả ñánh giá một số ñặc ñiểm nông - sinh học chính của dòng lúa
DT45 và DT47 tại Xã Hoàng ðông - Huyện Duy Tiên, Hà Nam. 101
3.31 Năng suất của thí nghiệm khảo nghiệm tại các ñiểm khảo nghiệm
khác nhau (giống DT45) 102
3.32 Năng suất của thí nghiệm khảo nghiệm tại các ñiểm khảo nghiệm khác
nhau (giống DT47) 102
3.33 Khả năng chống chịu của giống lúa DT45 và DT47 103
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
ix
DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Bệnh bạc lá lúa 8
3.1 Biểu ñồ thể hiện tính kháng của các dòng lúa mang gen kháng vi
khuẩn bạc lá 48
3.2 Phản ứng của các dòng vật liệu khi lây nhiễm nhân tạo 52
3.3 ða hình của chỉ thị RM6320 liên kết với gen kháng vi khuẩn bạc lá
xa5, giữa dòng cho và nhận gen kháng 53
3.4 Không ña hình của chỉ thị RG556 liên kết với gen kháng vi khuẩn bạc
lá xa5, giữa dòng cho và nhận gen kháng 53
3.5 ða hình của chỉ thị liên kết với gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa7, giữa
dòng cho và nhận gen kháng 54
3.6 Không ña hình của chỉ thị liên kết với gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa7,
giữa dòng cho và nhận gen kháng 54
3.7 ða hình của chỉ thị liên kết với gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa21, giữa
dòng cho và nhận gen kháng 54
3.8 Không ña hình của chỉ thị liên kết với gen kháng vi khuẩn bạc lá
Xa21, giữa dòng cho và nhận gen kháng 54
3.9 Xác ñịnh các cá thể lai F5/7 mang gen kháng xa5 và Xa7 57
3.10 Xác ñịnh các cá thể lai BC
1
F
1
mang gen kháng Xa7 và Xa21 60
3.11 Xác ñịnh các cá thể lai BC
2
F
1
mang gen kháng Xa7 và Xa21 63
3.12 Xác ñịnh các cá thể lai BC
3
F
1
mang gen kháng Xa7 và Xa21 66
3.13 Callus hình thành ở môi trường N6 (tổ hợp lai F1.5) và cây xanh tái
sinh ở môi trường MS (tổ hợp lai F1.7) 70
3.14 Cây bạch tạng thu ñược trong thí nghiệm 71
3.15 Các dạng cây xanh tái sinh thu ñược trong nuôi cấy bao phấn lúa 72
3.16 Xác ñịnh dòng ñơn bội kép mang gen kháng xa5 bằng chỉ thị phân tử 74
3.17 Xác ñịnh dòng ñơn bội kép mang gen kháng Xa7 bằng chỉ thị phân tử 75
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
x
3.18 Phản ứng của dòng ñơn bội kép MT5.4 với chủng bạc lá HAU02040 -
trường ðH Nông nghiệp Hà Nội 77
3.19 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR của các dòng MT5/7 77
3.20 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR của các dòng MT1 83
3.21 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR của các dòng MT2 86
3.22 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR của các dòng MT3 89
3.23 Sơ ñồ thể hiện kết quả chọn tạo dòng vật liệu ở các thế hệ lai trở lại 94
3.24 Dạng hạt của dòng triển vọng MT1.14 so với 2 dòng bố, mẹ 99
3.25 Quy trình chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá bằng kết hợp phương
pháp lai, chỉ thị phân tử và nuôi cấy bao phấn lúa 104



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
1

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài
Việt Nam những năm gần ñây tốc ñộ tăng dân số bình quân 1 triệu người/
năm, nhưng trái lại, diện tích ñất trồng lúa ñể cung cấp lương thực chính lại giảm
trung bình 58.700 ha/ năm. So với năm 2001 diện tích canh tác lúa giảm 325.000
ha. Vì vậy thâm canh tăng năng suất lúa là giải pháp quan trọng ñể ñáp ứng nhu cầu
lương thực cho người dân. Nhiễm sâu bệnh là một trở ngại của thâm canh lúa, ñặc
biệt bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae ). Bệnh bạc lá là một trong những
bệnh gây hại nguy hiểm nhất ảnh hưởng ñến năng suất lúa. Bệnh này ñã làm giảm
năng suất lúa từ 20-30% có khi tới 50% thậm chí 80-90% (Deng et al, 2006) [52].
Thời gian gần ñây, bệnh bạc lá ñã bùng phát trở lại ở Việt Nam và gây nhiều thiệt
hại cho sản xuất lúa ở nước ta. Hiện nay, biện pháp phòng trừ chính ñược dùng rộng
rãi ở tất cả các vùng trồng lúa là biện pháp sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên vẫn
chưa có thuốc ñặc hiệu, hơn nữa việc lạm dụng thuốc hóa học trong phòng trừ dịch
hại ñã gây ra những nguy hại mới ñối với môi trường sống, phá vỡ sự cân bằng sinh
thái, gây ô nhiễm môi trường và tác ñộng tới sức khỏe cộng ñồng.
Vi khuẩn bạc lá Xanthomonas oryzae pv. oryzae rất ña dạng về số chủng.
ðối với mỗi vùng sinh thái và vào những thời ñiểm khác nhau trong năm, tùy thuộc
vào ñiều kiện khí hậu và các yếu tố khác, thành phần cũng như cấu trúc của quần
thể vi khuẩn biến ñộng khác nhau. Nhật Bản phát hiện thấy có 12 chủng, ở
Philippine có 6 chủng, Ấn ðộ có 9 chủng, ở Việt Nam số chủng bạc lá ñã lên ñến
con số 15 (Bùi Trọng Thủy và cộng sự, 2008) [15].
Với những thành tựu ñạt ñược trong việc phát hiện và xác ñịnh các gen kháng vi
khuẩn bạc lá ñã ñặt nền tảng cho những thành công trong công tác chọn tạo giống
kháng bệnh. Hiện nay, khoảng 35 gen kháng vi khuẩn bạc lá ñã ñược tìm ra trên các
giống lúa dại, lúa trồng hoặc ñược tạo ra do sự thay ñổi di truyền. Các gen kháng vi
khuẩn bạc lá này ñược xác ñịnh nằm trên 9 nhiễm sắc thể lúa và ñược ký hiệu theo thứ
tự lần lượt từ Xa1 ñến Xa35. Các gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 ñược các chuyên gia lưu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
2

tâm nhất do các gen này khi tổ hợp cùng với nhau có phổ kháng rộng.
Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của chỉ thị phân tử, một quy trình
công nghệ chọn giống mới ñược ra ñời, ñó là chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS).
Sử dụng phương pháp MAS trong chọn giống rất có hiệu quả. Tuy vậy, chọn giống
nhờ MAS vẫn phải tuân theo quy luật di truyền (các cây thu ñược gồm cả cây ñồng
hợp tử, cây dị hợp tử và phải chọn lọc qua một số thế hệ mới chọn ñược dòng
thuần). Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn có thể khắc phục ñiều ñó chỉ trong một năm. Kỹ
thuật này có thể tạo ra các dòng ñồng hợp tử ñơn bội kép (DH) ngay từ những thế
hệ ñầu. Do vậy, nếu kết hợp phương pháp lai tích luỹ, sử dụng phân tử và nuôi cấy
bao phấn lúa, các nhà khoa học hoàn toàn có thể cùng một lúc chọn ñược nhiều tính
trạng khác nhau ñồng thời tiết kiệm ñược thời gian, nhân công và tiền bạc trong
việc chọn tạo giống.
Công tác chọn tạo các giống lúa mới kháng bền vững với bệnh bạc lá ñang là
ñòi hỏi rất cấp bách hiện nay ở Việt Nam. ðể ñạt ñược mục tiêu này, việc ứng dụng
các phương pháp công nghệ sinh học kết hợp với phương pháp lai truyền thống
trong chọn tạo các dòng thuần mang gen kháng bệnh bạc lá là rất cần thiết. Trên cơ
sở những phân tích trên chúng tôi ñã tiến hành thực hiện ñề tài: “Phát triển nguồn
vật liệu mang gen kháng vi khuẩn bạc lá (Xanthomonas oryzae pv. Oyzae) phục
vụ công tác chọn tạo giống lúa cho các tỉnh phía Bắc Việt Nam”
2 Mục tiêu của ñề tài
- Chọn tạo ñược tập ñoàn vật liệu di truyền mang gen kháng vi khuẩn bạc lá
bằng phương pháp chỉ thị phân tử và nuôi cấy bao phấn, phục vụ cho nghiên cứu và
chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc lá ở các tỉnh phía
Bắc Việt Nam.
- Khảo nghiệm, xác ñịnh ñược dòng triển vọng kháng bệnh bạc lá giới thiệu
cho sản xuất
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
* Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp nguồn vật liệu mới mang gen kháng vi khuẩn bạc lá làm vật liệu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
3

cho chọn tạo giống lúa thuần, lúa lai kháng bệnh bạc lá.
- Thiết lập quy trình chọn giống lúa kháng bạc lá bằng phương pháp lai
truyền thống kết hợp với chỉ thị phân tử và nuôi cấy bao phấn.
- Sử dụng dòng ñã ñược quy tụ nhiều gen kháng bệnh bạc lá làm vật liệu cho
gen trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bằng chỉ thị phân tử mang lại
hiệu quả cao hơn sử dụng dòng NILs mang ñơn gen kháng bệnh bạc lá.
* Ý nghĩa thực tiễn
Công nhận sản xuất thử giống lúa DT 45 ñưa ra sản xuất, giống lúa DT 47 có
triển vọng giới thiệu cho sản xuất.
4 Những ñóng góp mới của luận án
4.1. Sử dụng ñồng bộ phương pháp lai tạo truyền thống, chỉ thị phân tử và nuôi cấy
bao phấn lúa ñể tạo các vật liệu khởi ñầu mang gen kháng vi khuẩn bạc lá.
4.2. ðã tạo ñược 54 dòng vật khởi ñầu mang 1-2 gen kháng vi khuẩn bạc lá.
4.3. ðã ñóng góp một số dòng lúa phục vụ sản xuất trong ñó có giống lúa DT45
(mang gen kháng xa5) ñược công nhận sản xuất thử, giống lúa DT47 (mang gen
kháng Xa7) ñã khảo nghiệm 3 vụ có triển vọng.
5 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu
5.1 ðối tượng nghiên cứu: 6 giống lúa ñang phổ biến rộng trong sản xuất và 18
dòng lúa mang các gen kháng bệnh bạc lá của Viện nghiên cứu Lúa quốc tế IRRI.
5.2 Phạm vi nghiên cứu:
Nghiên cứu chọn tạo nguồn vật liệu mang gen kháng bệnh bạc lá phục vụ cho
công tác chọn tạo giống lúa ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam bằng kết hợp phương
pháp lai, chỉ thị phân tử, nuôi cấy bao phấn lúa và lây nhiễm bệnh nhân tạo.
5.3 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu
- ðịa ñiểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của bộ môn Sinh học phân tử, bộ
môn ðột biến & Ưu thế lai và ruộng thí nghiệm - Viện Di truyền Nông nghiệp.
- Thời gian nghiên cứu: 2006 - 2011

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và trong nước
1.1.1 Sản xuất lúa trên thế giới
Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng cho khoảng 2/3 dân số
thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương (FAO) của Liên Hiệp Quốc,
trên thế giới có khoảng 147,5 triệu ha ñất dùng cho việc trồng lúa, và 90% diện
tích này thuộc các nước châu Á với sản lượng chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo
trên thế giới.
Lúa gạo cung cấp từ 35-59% nguồn năng lượng cho hơn 3 tỷ người. ðể ñảm
bảo ñược nguồn lương thực, ñáp ứng cho mức ñộ tăng dân số của thế giới (tăng
khoảng 1 tỷ người sau 14 năm), trong 30 năm tới sản lượng lúa gạo yêu cầu tăng từ
470 triệu tấn hiện nay, lên 740 triệu tấn. Do diện tích cây trồng nói chung và cây lúa
nói riêng ngày một giảm, sản lượng lương thực buộc phải tăng mạnh hàng năm mới
ñáp ứng lượng dân số ngày một tăng nhanh.
Hiện nay trên thế giới có 114 nước trồng lúa và phân bố ở tất cả các Châu lục
trên thế giới. Trong ñó, Châu Phi có 41 nước trồng lúa, Châu á- 30 nước, Bắc Trung
Mỹ - 14 nước, Nam Mỹ - 13 nước, Châu Âu - 11 nước và Châu ðại Dương- 5 nước.
Về lúa gạo, Uỷ ban Ngũ cốc Quốc tế (IGC) dự báo sản lượng vụ 2010/11 sẽ
ñạt 450 triệu tấn, tăng so với 440 triệu tấn niên vụ trước. IGC dự báo, châu Á chiếm
90%, dẫn ñầu là Trung Quốc và Ấn ðộ. Theo dự báo của Ban Nghiên cứu Kinh tế -
Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, trong giai ñoạn 2007-2017, các nước sản xuất gạo ở châu
Á sẽ tiếp tục là nguồn xuất khẩu gạo chính của thế giới, bao gồm Thái Lan, Việt
Nam, Ấn ðộ. Riêng xuất khẩu gạo của hai nước Thái Lan và Việt Nam sẽ chiếm
khoảng nửa tổng lượng gạo xuất khẩu của thế giới. Một số nước khác cũng sẽ ñóng
góp giúp tăng sản lượng gạo thế giới như: Ấn ðộ, các tiểu vùng Sahara Châu Phi,
Bangladesh, Philippines, Brazil.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
5

Năm 1960, năng suất lúa bình quân trên thế giới là 1,04 tấn/ha. ðến năm
2008, năng suất lúa thế giới bình quân ñạt 4,25 tấn/ha. Nước sản xuất lúa ñạt năng
suất cao nhất là Uruguay 8,01 tấn/ha, kế ñến là Mỹ: 7,68 tấn/ha và Peru: 7,36
tấn/ha. Trong khi ñó nước có sản lượng cao nhất là Trung Quốc, năng suất chỉ ñạt
6,61 tấn/ha và Việt Nam sản lượng ñứng thứ năm, năng suất ñạt 4,88 tấn/ha. Nếu
năng suất lúa Việt Nam phấn ñấu bằng với Uruguay thì sản lượng sẽ tăng gần gấp
ñôi hiện nay. Sản lượng lúa trên thế giới năm 2008 là 661.811 triệu tấn (Tạp chí
STINFO, 2010) [12].
1.1.2 Sản xuất lúa ở Việt Nam
Nghề trồng lúa ở Việt Nam có lịch sử lâu ñời nhất so với nghề trồng lúa ở
các nước châu Á. Theo các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn ðộ, Việt Nam , cây
lúa ñã có mặt từ 3000 - 2000 năm trước công nguyên. Việt Nam có hai vùng trồng
lúa chính là ñồng bằng Sông Hồng ở phía bắc và ñồng bằng Sông Cửu Long ở miền
Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước ñạt 33-34 triệu tấn thóc, trong ñó chỉ sử
dụng khoảng 8 triệu tấn (tương ñương 4 triệu tấn gạo sau khi xay xát) cho xuất
khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia.
Ở miền Bắc một năm có hai vụ lúa chính: vụ chiêm và vụ mùa.
Ở miền Nam, nông dân trồng ba vụ một năm: vụ ñông xuân (có sản lượng
cao nhất và thóc cũng ñạt chất lượng tốt nhất cho xuất khẩu), vụ hè thu và vụ ba.
Trước năm 1945, diện tích trồng lúa ở 2 ñồng bằng Bắc Bộ và Nam Bộ là 1,8
triệu và 2,7 triệu ha với năng suất bình quân 13 tạ/ ha và sản lượng thóc tương ứng
2,4 - 3,0 triệu tấn. Trong thời gian này chủ yếu là các giống lúa cũ, ở miền Bắc sử
dụng các giống lúa cao cây, ít chịu thâm canh, dễ ñổ, năng suất thấp (Nguyễn Văn
Hiển, 2000) [10].
Từ năm 1989, khi Việt Nam, một nước thiếu lương thực lần ñầu xuất hiện là
nước xuất khẩu gạo với số lượng lên ñến 1 triệu tấn và sau ñó, từ 1990 ñến 2010 sản
lượng lúa từ 19 triệu tấn tăng lên 40 triệu tấn, xuất khẩu gạo từ 1,6 triệu tấn tăng lên
6,7 triệu tấn. Năng suất lúa bình quân toàn quốc ñã tăng từ 3,18 tấn/ha năm 1990
lên 5,3 tấn/ ha năm 2010. Tuy vậy, trong vòng 10 năm từ 2000 ñến 2010 diện tích
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
6

ñất lúa ñã giảm 380 nghìn ha. Diện tích lúa còn tiếp tục giảm theo tốc ñộ công
nghiệp hóa, ñô thị hóa và nếu không ñược kiểm soát nghiêm ngặt việc chuyển ñất
lúa sang các mục ñích phi nông nghiệp, an ninh lương thực lâu dài của ñất nước sẽ
bị ñe dọa khi dân số nước ta mỗi năm tăng trên 1 triệu người. Ngoài ra, do biến ñổi
khí hậu các vùng sinh thái, vùng trồng lúa sẽ mất cân bằng nghiêm trọng khi nguồn
nước cho canh tác trở nên ít hơn, hạn hán, lũ lụt nhiều hơn, xâm nhập mặn sâu hơn,
mật ñộ bộc phát dịch sâu bệnh hại lúa cao hơn, v.v.bởi vậy ta cần tạo ra các giống
lúa mới cho năng suất cao, chất lượng gạo tốt và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Bùi
Bá Bổng, 2011) [2].
Cùng với trình ñộ thâm canh của nông dân ngày một tiến bộ nên năng suất
lúa ở miền Bắc thường khá cao và ổn ñịnh. Tuy nhiên, một trở ngại lớn nhất của
ngành sản xuất lúa là thiệt hại do sâu bệnh gây ra, ñặc biệt là bệnh bạc lá. Bệnh bạc
lá lúa là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng nhất hiện nay ở nhiều nước
trên thế giới, trong ñó có Việt Nam. Trước ñây, ở miền Bắc bệnh phá hại nặng chủ
yếu ở vụ mùa, nhưng hiện nay do thâm canh cao và trồng nhiều giống nhập nội
nhiễm bệnh nên bệnh phá hại nặng ở cả vụ xuân (Phan Hữu Tôn, 2005) [18].
1.2 Bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá lúa tiếng Anh là Bacterial blight, tên khoa học ñầy ñủ là
Xanthomonas oryzae (Ishiyama) pv. oryzae, Swings. Năm 1922 do Ishiyama ñầu
tiên ñịnh nghĩa là Bacterium oryzay Ishiyama, năm 1939 Dowson ñổi tên là
Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson, năm 1978 Dye ñặt tên là X.campestris
pv. oryzae (Ishiyama) Dye; Năm 1990 Swings phục hồi lại tên Xanthomonas
oryzae. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá là Xanthomonas oryzae pv. oryzae, viết tắt là Xoo
(David et al, 2006) [51], (Swings et al, 1990) [105].
1.2.1 Những nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá lúa ñược phát hiện ñầu tiên tại Nhật bản vào khoảng năm 1884-
1885. Sau ñó Takashi (1908) và Bokusha (1911) ñã nghiên cứu và phân lập thành
công vi khuẩn và tiến hành lây bệnh nhân tạo bằng vi khuẩn phân lập. Tiếp sau
Nhật Bản, một loạt các nước ñã thông báo về bệnh bạc lá ở nước mình. Ở Việt
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
7

Nam, bệnh bạc lá ñã ñược phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, ñặc biệt từ
năm 1965-1966 trở lại ñây, bệnh thường xuyên phá hoại một cách nghiêm trọng ở
các vùng trồng lúa, trên các giống nhập nội có năng suất cao cấy trong vụ Chiêm
Xuân và ñặc biệt ở vụ Mùa (Lê Lương Tề và cộng sự, 2007) [13].
* Mức ñộ tác hại của bệnh phụ
thuộc vào giống, thời kỳ bị bệnh của cây
sớm hay muộn và mức ñộ bị bệnh nặng
hay nhẹ. Các nghiên cứu về mức ñộ thiệt
hại chỉ ra rằng, thiệt hại về năng suất
biến ñộng rất rộng tùy thuộc vào giai
ñoạn bị nhiễm bệnh, tính ñộc của từng
chủng vi khuẩn, mức ñộ nhiễm của
giống, ñiều kiện thời tiết và môi trường
khi bệnh diễn ra, biến ñộng từ 20-30%
có khi tới 50% thậm chí 80-90% (Deng
et al, 2006) [52].
* Triệu chứng ñiển hình của bệnh
bạc lá là ở thời kỳ lúa cấy trên ruộng từ
sau khi lúa ñẻ - trỗ - chín sữa, (xem
Hình 1.1). Theo IRRI (2007), biểu hiện triệu chứng của bệnh trải qua 3 pha. Pha
thứ nhất là: héo rũ, pha thứ hai là: úa vàng, pha thứ 3 là: bạc trắng và khô
* Nguyên nhân gây bệnh là do vi khuẩn xâm nhập vào cây có tính chất thụ
ñộng, vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm qua thuỷ khổng, qua các lỗ khí ở trên mút
lá, mép lá, ñặc biệt qua vết thương xây xát trên lá. Bệnh bạc lá tuy có phạm vi lan
truyền hẹp, song nó còn tuỳ thuộc vào mưa bão xảy ra vào cuối vụ Chiêm Xuân và
trong vụ Mùa, mà bệnh có thể lan truyền với phạm vi không gian tương ñối rộng,
giọt keo vi khuẩn hình thành nhiều, ñó là một trong những nguyên nhân quan trọng
làm cho bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh sau những ñợt mưa gió xảy ra.
* Ở Miền Bắc nước ta, bệnh bạc lá lúa có thể phát sinh phát triển ở tất cả các

1.Bệnh là mới 2.Bệnh lá hậu kỳ 3.4 Mủ vi
khuẩn 5.Heó lá 6.Bệnh cây chảy ra mủ
7. Dạng vi khuẩn [11]
Hình 1.1: Bệnh bạc lá lúa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
8

vụ lúa Chiêm Xuân và vụ Mùa. Sự phát triển và tác hại của bệnh phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như: Nguồn bệnh ban ñầu, ñiều kiện thời tiết, các giống lúa khác nhau,
thời kỳ cây bị nhiễm và phụ thuộc vào các biện pháp kỹ thuật canh tác. Trong
khoảng thời gian nhất ñịnh nào ñó tất cả các ñiều kiện trên trùng hợp tạo ñiều kiện
cho bệnh phát triển thì mức ñộ bị bệnh rất nặng, tốc ñộ lan truyền rất nhanh chóng,
tác hại của bệnh rất lớn (Lê Lương Tề, 2007) [13].
1.2.2 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
1.2.2.1 Vị trí phân loại
Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa có tên là Xanthomonas oryzae pv. oryzae Downson.
Dựa theo hệ thống phân loại của Bergey (1939) và Gorlenco (1966) thì loài
Xanthomonas oryzae thuộc chi Xanthomonas, họ Pseusomonadaceae, bộ
Eubacteriales, lớp Schizomycetes (Eubacteria).
Trong những năm gần ñây, phân loại vi khuẩn hiện ñại dựa trên các nghiên cứu
và phân tích trực tiếp cấu trúc ADN. Các cá thể, các isolate khác nhau nhưng cùng một
loài sẽ có cấu trúc di truyền tương tự nhau. Các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng, hàm lượng
các nucleotit (nu) G+C ñặc trưng cho mỗi loài và ñược sử dụng làm 1 trong những chỉ
tiêu phân loại. Theo ñó, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng G+C của
những loài trong chi Erwinia là 50 - 54%; Corynebacterium: 54 - 55%; Pseudomonas:
58 - 63%; còn ở Xanthomonas là 63 - 69% (Lê Lương Tề, 2007) [13].
1.2.2.2 ðặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm hoá sinh
Vi khuẩn Xanthomonas orryzae pv. oryzae có dạng hình gậy, hai ñầu hơi
tròn, có một lông roi ở một ñầu, kích thước 1- 2 x 0,5 – 0,9 µm.
Trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tròn, màu
vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm gram âm. Vi khuẩn không
có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH
3
, indol, nhưng
tạo H
2
S, tạo khí nhưng không tạo axit trong môi trường có ñường. Nhiệt ñộ thích
hợp cho vi khuẩn sinh trưởng là từ 26 - 30
o
C, nhiệt ñộ tối thiểu 0 - 5
o
C, nhiệt ñộ
làm vi khuẩn chết là 53
o
C. Vi khuẩn có thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7
– 8,5, thích hợp nhất là pH 6,8 – 7,2 (Lê Lương Tề và cộng sự, 2007) [13].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
9

1.2.2.3 ðặc ñiểm di truyền liên quan ñến tính gây bệnh
Trong hệ thống phân loại, Xanthomonas bao gồm 3 loài là Xanthomonas
oryzae pv. oryzae, Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xanthomonas campestis pv.
campestris. Bộ genom của Xanthomonas oryzae pv. oryzae có chiều dài xấp xỉ 5
triệu bp (4.940.217 bp), trong ñó thành phần G + C chiếm 63,72% và vùng mã hoá
protein chiếm tới 84,12% (Anjali, 2007) [26]. Về ñặc tính gây bệnh của vi khuẩn,
các nghiên cứu chỉ ra rằng có liên quan ñến 3 nhóm gen là: nhóm hrp, avr và hrpX .
- Nhóm gen hrp mã hoá cho hệ thống các enzyme tiết, có chức năng chuyển
các protein thụ thể vào tế bào cây chủ. Ở Xanthomonas oryzae pv. oryzae, nhóm
này bao gồm 27 gen khác nhau.
- Nhóm gen avr ñóng vai trò quyết ñịnh sự ñặc hiệu ký sinh - ký chủ. Chúng
mã hoá ra các yếu tố tạo nên ñộc lực của vi khuẩn, giúp vi khuẩn ký sinh, gây bệnh.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae bao gồm 17 bản copy các thành viên của họ gen
avrBs3/pth, một kiểu avr gene chính, ñược ñịnh vị trên 7 vùng khác nhau của bộ
genom (Lee et al, 2005) [37].
- Nhóm gen HrpX: Ở cả 3 loài thì sự biểu hiện của nhóm gen hrp và avr ñều
phụ thuộc vào sản phẩm của gen hrpG và hrpX. Một vài gen HrpX có sự ñồng nhất
về trình tự (TTCGC…N15…TTCGC), người ta ñặt tên cho nó là ñoạn PIP box. Vì
vậy, PIP box là ñặc ñiểm ñể phân loại các gen HrpX. Ở loài Xoo, các nghiên cứu ñã
tìm thấy có 37 bản copy hoàn chỉnh hoặc gần hoàn chỉnh của ñoạn PIP box trong
vùng khởi ñầu phiên mã của các gen, 5 trong số các gen ñó nằm trong vùng của
nhóm gen hrp, còn lại thì nằm rải rác khắp bộ genome của vi khuẩn.
Họ gen avrBs2 có ở cả 3 loài, họ gen avrBs1 chỉ tìm thấy ở Xanthomonas
campestis pv. campestris, còn họ gen avrBs3/pth xuất hiện phổ biến ở loài
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Anjali, 2007)[26]. Ở loài Xanthomonas axonopodis
pv. citri thì những gen avr ñều nằm trên plasmid. Còn ở loài Xanthomonas oryzae pv.
oryzae có 1 gen là thuộc họ gen avrBs2 còn lại ña số thuộc họ gen avrBs3 và nằm trong
cấu trúc genom của vi khuẩn. Ví dụ như Avrxa5 thuộc nhóm AvrBs3, AvrXa7 cũng là
một thành viên của họ gen avrBs3 (Yang et al, 2004) [35], (Chen et al, 2008) [97].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
10

AvrXa7 có ñặc trưng là chứa trình tự lặp ở vùng trung tâm. ðoạn sợi kép của AvrXa7
rất giàu trình tự T. Nếu xảy ra ñột biến ở vùng kết thúc có chứa trình tự CCC thì
AvrXa7 sẽ trở thành avrXa7 (tức là gen gây ñộc). AvrXa21 muốn hoạt ñộng ñược ñòi
hỏi sự có mặt của các gen raxA, raxB, raxC, những gen mã hoá cho các thành phần của
hệ thống bài tiết. Trong khi ñó với loài Xanthomonas campestris pv.campestris thì
AvrXa21 chỉ hoạt ñộng khi có gen raxA và raxST, mã hoá ra enzym sulfotransferase.
Sự biểu hiện của các gen rax lại phụ thuộc vào mật ñộ chủng quần cũng như các gen
rax chức năng khác (Pandey et al, 2010) [24], (Lee et al, 2008) [95].
1.2.2.4 Các chủng sinh lý
Vi khuẩn bạc lá rất phong phú và ña dạng về thành phần chủng. Các
nghiên cứu ñể phân chia thành các chủng sinh lý ñều dựa trên ñộc tính gây bệnh
của chúng trên các giống lúa khác nhau. Tuy nhiên, mỗi quốc gia lại gieo trồng
các giống khác nhau vì thế ñể phân nhóm và so sánh các chủng sinh lý giữa các
quốc gia, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) và Nhật
Bản xây dựng nên hệ thống các dòng lúa phục vụ cho mục ñích trên (Anjali et al,
2007) [26]. Hệ thống này bao gồm các dòng NILs ñược tạo ra dựa vào việc lai
chuyển các gen kháng vào nền gen của 3 giống IR24, Toyonishiki và Milyang 23
(Yang et al, 2004 [35].
Ở Nhật, có rất nhiều hệ thống phân loại nhóm chủng, nhưng theo hệ thống
của Noda and Ohuchi năm 1989 thì các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
oryzae phân thành 12 nhóm dựa vào khả năng gây bệnh trên các giống lúa khác
nhau Philippin có sáu nhóm (nhóm I – nhóm VI), Ấn ñộ có 9 nhóm (Swamy et
al, 2006) [91].
Ở Việt Nam, nghiên cứu thành phần chủng vi khuẩn cũng ñã ñược tác giả Lê
Lương Tề và Tạ Minh Sơn thực hiện năm 1987, dựa trên 8 dòng chỉ thị mang các
gen kháng Xa2; Xa3; Xa4; xa5; Xa7; Xa10; Xa11; Xa14. Các tác giả phân các
chủng thành 10 nhóm (nhóm I - nhóm X). Theo những nghiên cứu gần ñây của Bùi
Trọng Thuỷ dựa trên 11 dòng chỉ thị mang các gen kháng Xa1, Xa2; Xa3; Xa4; xa5;
Xa7; Xa10; Xa11; Xa12, Xa14, Xa21 thì thành phần chủng gây bệnh bạc lá ở miền
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
11

Bắc, Việt Nam rất ña dạng (Bùi Trọng Thủy và cộng sự, 2008) [14]. Theo kết quả
nghiên cứu của Cục Bảo vệ Thực vật về sự ña dạng di truyền một số chủng vi khuẩn
gây bệnh ở miền Bắc bằng cặp mồi XOR ñặc hiệu cho thấy 47 chủng phân lập ñược
phân chia thành 13 nhóm chủng [3]. ðiều ñó chứng tỏ thành phần các chủng sinh
thái ở miền Bắc Việt Nam rất ña dạng và phong phú.
1.2.2.5 Tương tác ký sinh - ký chủ, thuyết gen ñối gen
Dựa trên các kết quả của Flor (1940), ông ñã tiến hành một thí nghiệm nhằm
tìm hiểu cách thức kháng bệnh ở cây trồng, các nhà khoa học ñã ñưa ra thuyết “gen
ñối gen” ñược phát biểu như sau: cứ mỗi một gen R quy ñịnh tính kháng ở giống
cây ký chủ thì có một gen a quy ñịnh tính ñộc ở chủng ký sinh, không trước thì sau
gen ñộc a tương ứng này sẽ vượt qua ñược gen kháng R dẫn ñến tình trạng nhiễm
bệnh. ðồng thời, cứ mỗi một gen kháng R ở giống cây ký chủ cũng sẽ có một gen A
tương ứng ở ký sinh ñể kích hoạt cây ký chủ hình thành các phản ứng tự vệ chống
lại gen A ñó dẫn ñến tình trạng không nhiễm bệnh.
Theo nghiên cứu của Flor, trong hệ gen của các giống cây trồng thường chứa
những gen có chức năng mã hóa tạo ra những phân tử tiếp nhận giúp cho ký chủ
nhận biết ñược ký sinh tấn công vào, từ ñó phát ñộng các phản ứng tự vệ khác nhau
ñể chống lại ký sinh. Giống cây trồng ñó ñược gọi là có gen kháng (R).
ðối với ký sinh, chủng ký sinh nào có thể gây hại ñược trên một giống cây
ký chủ có gen kháng R thì trong hệ genom của chủng ñó phải có ít nhất một gen ñộc
a có thể vượt qua ñược gen R, khi ñó gen ñộc a ñược coi là gen ñộc tương ứng với
gen kháng R (Flor, 1971) [54].
Theo mô hình của Flor, các gen kháng ñều có tính trội. Tuy nhiên, mô hình
này chưa giải thích ñược trường hợp gen kháng là gen lặn.
Sau Flor, một số nhà khoa học ñã nghiên cứu về vấn ñề này trên một số ñối
tượng khác và thấy rằng thuyết “gen ñối gen” này ñúng trong nhiều trường hợp. Từ
ñó giúp ta ñưa ra một số nhận ñịnh sau về mối quan hệ ký sinh – ký chủ:
- Cứ mỗi một gen kháng dọc ở cây ký chủ (có 1 gen kháng) thì có một gen
ñộc tương ứng ở ký sinh có khả năng vượt qua gen kháng ñó ñể lây nhiễm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
12

- Chủng ký sinh nào chỉ có thể nhiễm trên cây ký chủ không có gen kháng là
chủng ký sinh không có gen ñộc; ngược lại, giống nào mà bị nhiễm bởi bất kỳ
chủng nào trong quần thể ký sinh ñó là giống không có gen kháng hay còn gọi là
giống nhiễm chuẩn.
- Chủng ký sinh nào có thể nhiễm trên tất cả các loài ký chủ thì nó là chủng
có tất cả các gen ñộc của loài ký sinh ñó và là chủng ñộc nhất tại thời ñiểm ñó;
giống ký chủ nào chỉ bị nhiễm bởi một chủng ký sinh duy nhất trong quần thể ký
sinh ấy sẽ là giống có ñầy ñủ các gen kháng hiện có mặt cũng tại thời ñiểm ñó.
Trong cuộc ñấu tranh ñồng tiến hóa này, cây trồng luôn tìm cách chống lại
sự xâm nhiễm của ký sinh, còn ký sinh thì luôn biến ñổi vượt qua hàng rào bảo vệ
ñó ñể có thể gây bệnh. Quá trình biến ñổi, thích ứng trong mối quan hệ giữa ký sinh
– ký chủ luôn luôn diễn ra trong tự nhiên và không bao giờ ngừng nghỉ (David,
2006) [51].
1.2.3 Các gen kháng bệnh bạc lá lúa
Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gen kháng bệnh bạc lá lúa ñược
thực hiện tại Nhật Bản vào ñầu thập kỷ 60 (Wu et al, 2008) [117]. Cho ñến những
năm 80 của thế kỷ XX, Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế ñã xác ñịnh bản chất di
truyền tính kháng bệnh là do gen quy ñịnh. ðiều này ñược khẳng ñịnh chắc chắn
nhờ vào những nghiên cứu của các nhà khoa học cùng những kỹ thuật hiện ñại.
Những gen kháng chủ lực từ nhiều nguồn tài nguyên di truyền ñã ñược xác ñịnh
(Singh et al, 2007) [98]. Cho ñến nay (năm 2011), có 35 gen (ñược ký hiệu theo thứ
tự lần lượt từ Xa1 ñến Xa35) ñiều khiển tính kháng bệnh bạc lá ở lúa ñược công
bố, (Ninxo, 2006) [85], (Yang, 2003) [121], (Chen et al, 2011) [41]. Các gen
kháng vi khuẩn bạc lá này ñược xác ñịnh nằm trên 9 nhiễm sắc thể lúa. 22 gen là
gen trội (dominant) (Xa), Mười một trong số ñó là gen lặn bao gồm: xa5, xa5(t),
xa8, xa13, xa15, xa19, xa20, xa24, xa28, xa31 và xa32 (Kottapalli, 2007) [71],
(Chu, 2006) [130]. Các gen kháng vi khuẩn bạc lá có thể bị kiểm tra bởi một gen
ñơn trội (Xa1, Xa7, Xa21 ) hoặc một gen ñơn lặn (xa5, xa13, xa24 ) hoặc do
hai gen liên kết với nhau như : Xa1/Xa4, Xa1/Xa7, Xa1/Xa10 Một số gen kháng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
13

có cấu trúc Protein tương ñối giống nhau, chúng có trình tự axitamin giống nhau
tới 53%, các nhà khoa học kết luận là do chúng liên kết chặt hoặc do chúng allen
với nhau như Xa26 có protein gần giống Xa21, Xa22(t), Xa3 (Wang et al, 2006)
[99], (Sun et al, 2004) [120], (Xiang et al, 2006) [122]. Phần lớn các gen này ñã
ñược phát hiện từ loài phụ Indica, hoặc từ lúa hoang dại O. longistaminata, O.
rufipogon, O. minuta và O. officinalis, chỉ có một số ít ñược phát hiện từ loài
phụ Japonica hoặc ñược tạo ra do sự thay ñổi di truyền (Zhang et al, 2009)
[125], (Chu et al, 2006) [127]. Riêng ba gen lặn xa15, xa19 và xa20 ñược tạo ra
bởi ñột biến cảm ứng (Lee et al, 2003) [73].
Một số gen kháng vi khuẩn bạc lá và các chỉ thị phân tử liên kết gần với các
gen này ñã ñược ñịnh vị trên bản ñồ nhờ sử dụng các phương pháp RFLP, RAPD,
STS, SSR (Sengsai et al, 2007) [101]. Các gen này ñược xác ñịnh nằm trên các
nhiễm sắc thể khác nhau như: Trên nhiễm sắc thể 1 có gen (Xa29t và xa34) (Chen et
al, 2011) [41], (Tan et al, 2004) [106], gen xa24 ñược xác ñịnh nằm trên tay dài
nhiễm sắc thể số 2 (Wu et al, 2008) [108], nhiễm sắc thể 4 có 5 gen (Xa1, Xa2, Xa12,
Xa14, Xa31) (Chen et al, 2000) [40], (Wang et al, 2009) [50]; nhiễm sắc thể 5 có
gen (xa5) (Guo et al, 2010) [60], nhiễm sắc thể 6 có gen (Xa7, Xa27t ) (Gu et al,
2004) [58], (Wu et al, 2008) [74], (Yoshimura et al, 1998) [125], nhiễm sắc thể 7 có
gen (xa8), nhiễm sắc thể 8 có (xa13) (China Papers 69035, 2010) [45], (Chu et al,
2004) [47]. Trên tay dài của nhiễm sắc thể 11 chứa nhiều gen kháng nhất, có gen
(Xa3, Xa4, Xa10, Xa21, Xa22t, Xa23, Xa26(t), Xa32(t) và Xa35 (Arif et al, 2008)
[27], (Wang et al, 2003) [49] nhiễm sắc thể 12 có gen (Xa25t, xa32) (Chen et al,
2000) [40]. Hiện nay ở nhiễm sắc thể 3, 9, 10 chưa phát hiện gen kháng bệnh bạc lá.
Cho ñến nay ñã có 6 gen kháng vi khuẩn bạc lá ñược lập bản ñồ vật lý
(physical mapping) ñồng thời ñược phân lập, tách dòng trên cơ sở bản ñồ (map-
based cloning) và xác ñịnh rõ chức năng gen. ðó là các gen (liệt kê theo thứ tự thời
gian) Xa21, Xa1, Xa26, xa5, Xa27 và xa13 (Gu et al, 2005) [59], (Sun et al, 2004)
[103], (Yoshimura et al, 1998) [124].
Nhà khoa học người Nhật Bản Sakaguchi (1967) là người ñầu tiên phát hiện ra
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………
14

2 gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa1 và Xa2. Gen Xa4 ñược các tác giả Trung Quốc lập
bản ñồ trên nhiễm sắc thể số 11 (Wang et al, 2000) [114]. Qua nhiều nghiên cứu các
nhà khoa học ñã ñưa ra kết luận: Các gen xa5, Xa7, Xa21 là các gen kháng hữu hiệu có
thể kháng ñược với nhiều chủng bạc lá khác nhau trên thế giới hiện nay (Lang et al,
2008) [72].
Gen kháng vi khuẩn bạc lá xa5 là một gen lặn, nằm trên nhiễm sắc thể số
5. ðể lập bản ñồ phân giải cao cho gen này, các nhà khoa học ñã tiến hành sàng
lọc quần thể F2 bao gồm 1016 cá thể từ tổ hợp lai giữa dòng NILs mang gen xa5
với dòng mẹ tái tục (recurrent parent line). Gen xa5 ñược ñịnh vị giữa 2 chỉ thị
RS7 và RM611 cách nhau 0,5 cM, trải dài trên 1 ñoạn ADN có kích thước 70 kb
với 11 khung ñọc mở (Blair et al, 2003) [36]. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy
gen xa5 mang chức năng của 1 yếu tố phiên mã. Cụ thể, nó mã hoá cho 1 tiểu
ñơn vị gamma của yếu tố phiên mã IIA. Như vậy tính kháng của gen xa5 không
tuân theo cơ chế của một gen kháng ñiển hình. Giải trình tự ADN của gen xa5
cho thấy giữa alen trội và alen lặn chỉ có sự khác biệt bởi 2 nucleotide dẫn tới sự
thay ñổi 1 axit amin (Iyer and McCouch, 2004).
Gen Xa7 ñược phát hiện từ giống lúa DV85 của Viện Lúa Quốc tế IRRI và
ñược ñịnh vị trên nhiễm sắc thể số 6, sau ñó ñược lập bản ñồ trên cơ sở tổ hợp lai
IR24xIRBB7 thông qua kỹ thuật AFLP. Tiếp theo, các chỉ thị phân tử M1, M3 và
M4 ñược xác ñịnh có liên kết gần với gen Xa7, trong ñó M3 và M4 nằm cách gen
Xa7 với khoảng cách tương ứng là 0,5 và 1,8 cM (Obert et al, 2004) [86]. Một số
tác giả Trung Quốc tiến hành lập bản ñồ vật lý cho 1 gen ở giống lúa Zhenhui 084
cùng alen với Xa7 (Zhang et al, 2009) [129]. Gen Xa7 biểu hiện tính kháng rộng ñối
với nhiều chủng vi khuẩn bạc lá (Gu et al, 2008) [57], (Vera et al, 2000) [111].
Giống lúa mang gen kháng Xa7 ñược thử nghiệm tính kháng bạc lá trong 11 năm
(22 vụ) liên tiếp với 1 chủng vi khuẩn bạc lá. Sau 22 vụ liên tiếp, thành phần quần
thể vi khuẩn thay ñổi, trong ñó nhóm gây ñộc tăng lên. Mặc dù vậy, gen Xa7 vẫn tỏ
ra kháng khá hiệu quả ñối với vi khuẩn bạc lá, nhất là khi nhiệt ñộ môi trường
tương ñối cao, trong khi các gen kháng khác dường như không chịu sự ảnh hưởng

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tải bản đầy đủ ngay

×